影响因素及存在问题

四、影响因素及存在问题

直接影响DNA芯片技术成败的因素有：DNA的浓度、点样稀释液的选择、点样环境的清洁度、点样的温度及湿度等。

（一）DNA的浓度

DNA的浓度及其片段长度会影响DNA溶液的亲水性、疏水性和黏稠程度等，这些性质会影响样品点在载体上的成形。

点样液主要是为了稳定DNA，延长其保质期。点样液中的高盐成分亦有助于样品点的成形。在点样液中加入一定量的洗涤剂可增加样品液的亲水性，巩固样品与载体的结合。注意，样点上的DNA在实验中所采用的激光波长下也会发出弱荧光，且在玻片之间有差异。

（二）样点的形状

实际情况是部分或所有的样点有“彗星尾”，且拖尾方向一致。样点的颜色也反映在拖尾中。这一现象可能是由于没有完全而快速地将玻片浸没在Succinic Anhydride封闭液中，使从样点洗脱下来的DNA又结合到玻片上。若有拖尾的样点彼此是分离的，则这种玻片依然是可用的。

另一现象是“面包圈孔”。用点样针点样时，并不是留下一个均一的圆，较多物质滞聚在样点的外围部分，而中央部分相对较少。这一现象可通过延长再次水化合的时间来解决。

（三）高荧光背景

强荧光背景导致芯片模糊是常见的问题。强荧光背景可以出现在整个芯片上，也可出现在一个局部区域。如果在杂交前预先系统地扫描芯片，覆盖整个芯片的强荧光背景是可以避免的。这种现象局限于杂交区，说明标记的扩增产物黏着于玻片表面，在洗片时没有被冲洗掉。导致这一结果有两种可能性，一种是poly lysine的氨基基团封闭不足，另一种是在杂交中标记的扩增产物非特异吸附。后一种来源的强荧光背景通常伴随着“anti probe”现象，它只出现在非样点区域，反映出这一区域的poly lysine容纳DNA的能力降低。

在某种情况下，芯片的一边背景较差，提示其与玻片在液体媒介（可能是封闭液）中放置的方向有关。若强荧光背景易出现在盖玻片的边缘，提示探针在杂交中脱水析出，但通过在杂交舱中加多点3×SSC，并确保封好杂交舱可得以解决。均一的强荧光背景也可能是由于探针不合格导致的，这时重新制备探针往往能改善效果。

（四）局部信号微弱

大部分强荧光背景现象都伴随特异性信号减弱，因为探针的信号被芯片强荧光背景所掩盖。然而，不伴有强荧光背景的信号微弱也可能发生，常是因为这一区域的探针层太薄而引起的，增加探针的数量有助于改善效果。芯片和（或）盖玻片表面的气泡和不匀质也能引起这种结果。仔细选择和放置玻片与盖玻片可减少这个问题。

（李　莉）