真菌感染的实验室诊断

实验室诊断是感染性疾病的重要诊断依据之一，真菌感染也不例外。实验室检查阳性对确立真菌感染具有重要意义，尤其对于缺少特征性临床表现的深部真菌感染。传统的真菌感染诊断方法有真菌镜检、真菌培养、真菌组织病理。随着真菌病患者的不断增多，临床对深部真菌感染的早期、快速诊断的需要越来越强。近年来，出现了血清学诊断和分子生物学诊断方法，其中不少仍处于实验室研究阶段，尚未应用于临床。

一、临床标本的收集与处理

临床标本的正确采集和处理是保证检验结果可靠的重要因素。首先，理想的标本应取自恰当的部位，以反映疾病的状态和进程；其次，标本的量要足够用于检查；再次，要保证标本的新鲜。下呼吸道分泌物、尿液、血液、胸腔积液、脑脊液等最好立即送检；如需运送，冰箱保存或冷藏不要超过8小时，以免标本变质。最后，还要考虑到标本污染的可能，尤其是非无菌部位的取材，如痰液、尿液等。

（一）皮肤、黏膜、指甲、毛发

取皮损的边缘、疱壁、脓液、深层趾（指）间皮屑或活动边缘皮屑，取材前将皮损用75%乙醇消毒，减少培养时细菌污染的机会。如果皮损处应用了软膏、粉剂等药物时，要先去除。做KOH涂片，同时种植于沙氏琼脂加氯霉素2管，置25℃培养2周。

用窥阴器从阴道及宫颈处取白色假膜或豆腐渣样凝块。男性标本用灭菌湿棉拭子深入尿道约2．5cm旋转取出。口腔黏膜取材用刮片方法比拭子要好。

甲标本应尽可能取甲的近端损害处，且应包括全甲厚度。标本接种于沙氏培养基培养4周，并同时做KOH涂片。

毛发要取变色、无光泽、弯曲、易折断、松动、易拔除的病发。用75%乙醇消毒，3～5根做直接镜检，5～10根种于沙氏琼脂（加氯霉素），划破斜面掩埋。如怀疑头皮隐性感染，也可用梳子梳头后将其压在琼脂培养基表面进行培养。

（二）眼、耳

对疑为真菌性角膜感染时，应请眼科医师取材。在手术显微镜下，以眼科刮匙刮取溃疡部位。拭子不适宜角膜部位的取材。疑为真菌性眼内炎者，应尽可能取玻璃体液。耳部取材应从耳道刮取，也可用拭子取材。

（三）脓液或溃疡、窦道、瘘管部位

以75%乙醇消毒病变部位的表面，注意无菌采集，以尽可能减少更多的污染。可直接刮取脓液、窦道或瘘管壁及其周围，尽量深取。如脓肿尚未破溃，可用注射器抽取。注意脓液中是否有颗粒，可用无菌蒸馏水稀释后寻找。标本做常规KOH涂片，革兰染色、PAS染色也很有必要。标本接种在含放线菌酮、氯霉素的沙氏培养基及只含氯霉素或不含抗生素的沙氏培养基；另外，还可选用脑心浸汁做厌氧培养。

（四）血液

无菌抽血3～5ml立即置于无菌抗凝管中，每天检查完毕后需摇动培养基，37℃震荡培养可加速真菌的生长，提高检出率。一般不做直接检查，因其阳性率低。

（五）其他无菌体液

无菌抽取脑脊液3～5ml置于无菌试管，立即送检，置4℃不宜超过1h。离心后以无菌吸管吸取离心沉淀物，做墨汁涂片镜检，取1ml沉淀物接种于无抗生素沙氏培养基上，25℃培养2～4周。

腹水、胸腔积液、关节腔液，应注意在无菌操作的条件下收集和立即送检标本。如需运送，可在4℃条件下保存过夜。标本采集量至少需要5ml，离心沉淀，取沉淀液做直接镜检；取2ml沉淀液接种于含氯霉素的沙氏琼脂培养基或无抗生素的培养基。

骨髓标本对隐球菌病、组织胞浆菌病、马尔尼菲青霉病、副球孢子菌病的诊断很有意义。装骨髓的无菌试管内要加有肝素。穿刺后，骨髓应立即送检，培养基选用不加抗生素的沙氏培养基，也可另外接种在脑心浸汁培养基上。

（六）组织

取材后剪成长、宽、高各1～2mm的小块，直接接种到培养基或置于含有生理盐水的无菌容器中，KOH涂片及培养。

（七）痰液、支气管灌洗液

无菌生理盐水漱口数次后，留晨痰3～5ml于无菌瓶中，挑取黏液或脓性部分。对免疫受损的患者，下呼吸道标本的收集方法常采用支气管肺泡灌洗或支气管灌洗，这可为真菌的镜检和培养提供良好的材料。标本直接KOH涂片、培养，或离心后进行。取标本时，应特别注意取痰液或灌洗液中灰白色或灰绿色的点状悬浮颗粒进行镜检或培养。

（八）尿液

早晨中段尿或清洁尿10ml，导尿的患者则取导尿管的中段尿或膀胱穿刺获取尿液。离心尿液，取沉淀液做KOH涂片检查，1ml接种于沙氏培养基。

（九）粪便

纸盒送检，挑取黏液、脓血、乳酪样部分KOH涂片、培养（加抗生素）。单纯培养阳性，不一定有临床意义，KOH涂片发现菌丝，有诊断意义。

（一）真菌镜检的步骤与方法

直接镜检法是形态学检查的基本方法，也是最简单、快速、实用的实验室诊断方法。阳性结果可确定真菌感染，但阳性率较低；阴性结果不能排除诊断，与培养检查结合才能更好地为临床服务。如在无菌体液的直接镜检中发现真菌成分常可确立深部真菌病的诊断。但在有菌部位只有发现大量真菌菌丝才具有诊断意义，有经验的检验师通过直接镜检一般可以区分念珠菌、隐球菌、毛霉菌等真菌的感染。

采用10%～20%KOH溶液做浮载液。取适量标本置于载玻片上，加一滴10%～20%浮载液，盖上盖玻片，放置片刻或微加热，即在火焰上快速通过2～3次，不应使其沸腾，以免结晶。然后轻压盖玻片，将标本压薄，用棉拭或吸水纸吸去周围溢液，置于显微镜下检查。为了防止制好的玻片干燥、KOH形成结晶，可向KOH溶液中加入甘油和二甲亚砜。检查时，先将光圈缩至最小，调整好光源的强度，用低倍镜将标本全部观察一遍，发现有可疑菌丝（假菌丝）或孢子的部位，再用高倍镜全面仔细地观察其大小、形态、数量、透明度、有无分枝、有无横隔等特征。皮肤鳞屑标本直接镜检，一般可见到的是透明、有隔、常为分枝的菌丝（假菌丝）及成链状排列的关节孢子（图1－14）。需要注意的是，玻片中经常有很多与真菌细胞相似的物质，如血细胞、上皮细胞、油滴、气泡、氢氧化钾结晶、纤维、玻片裂痕及其他杂质，务必严格鉴别和区分。

图1－14　念珠菌阴道炎患者阴道分泌物中念珠菌假菌丝

（二）染色检查

在载玻片上滴1滴生理盐水，将所采集的标本均匀地涂在载玻片上，自然干燥后，火焰固定或甲醇固定。再选择适当的染色方法染色，以高倍镜或油镜观察。常用真菌镜检染色方法见表1－4。

表1－4　常用真菌镜检染色方法

三、真菌培养检查及菌种鉴定

真菌培养检查的目的是为了进一步提高对病原体检出的阳性率，以弥补直接镜检的不足，同时确定致病菌的种类。培养时间一般为4周，个别生长缓慢的菌则需更久，如组织胞浆菌。所以不能过早报结果，以免造成假阴性结果。基础分离时培养温度应选择室温，最高不超过35℃，以免抑制一些病原真菌的生长。温度也可成为鉴定真菌的手段之一，如双相真菌在不同温度形成的菌落形态不同，烟曲霉能在45℃高温生长等。

（一）真菌培养常用培养基及其用途

由于各种真菌生长的营养条件不同，培养不同的真菌所用培养基也有所不同。表1－5列出了真菌培养和菌种鉴定常用的培养基。

表1－5　常用真菌培养基

（二）真菌培养方法

真菌培养检查除需要一般细菌检验所需的器具外，还应准备真菌专用的接种针、接种环或接种钩、微型小铲、刀片、针头等。视临床标本的不同，可酌情选用接种的方法。①点植法：适用于皮屑、甲屑、毛发、痂皮、组织等有形固体标本，将标本直接与培养基表面点状接触。②划线法：适用于痰、分泌物、脓液、组织液、组织块的研磨液等液体标本，用接种针（环）划线接种在培养基表面。培养方法按临床标本接种时间分为直接培养法和间接培养法；按培养方法分为试管法、平皿法和玻片法（小培养）。

1．试管培养　试管培养是临床上最常用的培养方法之一，主要用于临床标本分离的初代培养（图1－15）。

2．平皿培养　平皿培养是将培养物接种在培养皿中，主要用于纯菌种的培养和研究（图1－16）。

3．玻片培养　又称小培养，主要用于菌种鉴定。常用方块法和铜圈法。

（1）方块法：取无菌平皿，倒入约15ml熔化的培养基，待凝固后用无菌小铲或接种刀划成1cm2大小的小块。取一小块移在无菌载玻片上，然后在小块上方四边的中点接种待鉴定菌株，盖上消毒的盖玻片，放入无菌平皿中的V形玻棒上，底部铺上无菌滤纸，并加入少量无菌蒸馏水，孵育，待菌落生长后直接将载玻片置显微镜下观察。

（2）铜圈法：先将固体石蜡加热熔化，取直径约2cm、厚度约0．5cm有孔口的不锈钢小铜圈，火焰消毒后趁热浸入液状石蜡，旋即取出冷却，液状石蜡即附着于小铜圈中。再取一无菌载玻片，火焰上稍加热，将小铜圈平置其上，孔口向上。小铜圈上液状石蜡遇载玻片的热即熔化，液状石蜡再次凝固后铜圈就会固定在载玻片上。用无菌注射器经孔口注入熔化的培养基，培养基量约占小铜圈容量的1／2，注意避免气泡。待培养基凝固后取一消毒盖玻片，火焰上加热后，趁热盖在小铜圈表面，也即固定其上。最后用接种针伸入孔口进行接种。这种方法的优点是形成一种封闭式培养，不易被污染（图1－17）。

图1－15　试管培养

图1－16　平皿培养

图1－17　铜圈法小培养

（三）菌种鉴定

培养菌株应尽可能鉴定到种。目前酵母菌的鉴定体系比较规范，如采用API20C和全自动微生物鉴定体系等。值得指出的是，一些显色培养基往往对白念珠菌和几种常见的念珠菌鉴定比较可靠，而对其他少见菌种则要靠几种方法互相验证，不能仅依据颜色变化来判定。丝状菌的鉴定对鉴定人员的知识和经验要求较高，鉴定者不但要熟练掌握各种真菌的菌落形态、镜下形态和产孢方式（详见本章第一节），在鉴定时还要查阅大量文献和专业书籍，有时需要数周的时间重复多次接种才能得出正确结果。另外，分子生物学方法已成为菌种鉴定的重要辅助手段。

（四）真菌培养阳性的临床意义

一般来说，一旦培养出肯定的致病菌如新生隐球菌、组织胞浆菌、马尔尼菲青霉时，可确立感染的存在。但如果分离出条件致病菌如白念珠菌或烟曲霉时，则应结合临床情况进行判断。从无菌部位如血液或脑脊液中分离出条件致病菌常提示肯定的感染，但对来自于脓、痰或尿的标本则应谨慎解释结果，单靠一次培养阳性往往不能确定诊断，需重复3次以上，有时还需结合直接镜检的结果。鉴于目前条件致病性真菌感染不断增加的现状，难以排除少见真菌引起感染的可能性。因此，在没有经过认真分析之前，任何一株培养物都不应被视为污染菌。强调临床医师与实验室检验人员之间应保持密切联系，共同分析阳性结果的临床意义。

四、病理诊断

真菌病的组织病理检查与直接镜检和培养同样具有重要价值，尤其对深部真菌病的诊断意义更大，如用特殊染色可提高阳性率。

（一）组织病理

真菌感染的组织病理缺乏特异性，只有组织内找到真菌成分才能确定真菌感染。同一菌种在不同的组织内，或虽在同一组织内但病期不同，组织反应也不一定相同，一般病变早期多为化脓性改变，而在晚期多为肉芽肿性改变。浅表和浅部真菌感染可以表现为无炎症反应如花斑糠疹、掌黑癣、各种癣；也可以表现为急性或慢性化脓性改变如念珠菌病、足菌肿等。皮下组织的慢性真菌感染，如孢子丝菌病、芽生菌病、球孢子菌病、着色芽生菌病等表现为弥漫性皮炎的病理模式，为巨噬细胞、淋巴细胞、浆细胞、嗜酸性粒细胞的混合性炎细胞浸润。曲霉、接合菌有亲血管性，以接合菌更为明显，常在受累部位形成血栓，导致组织坏死。

真菌在组织内一般表现为：①孢子、酵母菌和双相型真菌在组织内表现为孢子。根据孢子的形态，以下真菌引起的感染基本可以确定致病菌到种的水平：荚膜组织胞浆菌、新生隐球菌、皮炎芽生菌、马尔尼菲青霉、杜波伊斯组织胞浆菌等。②菌丝，许多真菌在组织中只表现为菌丝。根据菌丝的形态，有时可以确定致病真菌到属的水平，但不能确定到种。例如，发现无色分隔、分枝的菌丝多为念珠菌和曲霉。粗大、不分隔少分枝或无分枝的菌丝为接合菌；棕褐色菌丝为暗色丝孢霉病，由暗色真菌引起。③其他，足菌肿的组织内可见菌丝形成的团块。球孢子菌或鼻孢子菌在组织内的特征性结构为球囊或内孢囊。硬壳小体是着色芽生菌病特有的表现。各种真菌在组织内的形态见表1－6。

表1－6　各种真菌在感染组织内的形态

（续　表）

（二）组织病理染色方法

常规的HE染色适合观察组织内炎症反应的情况，真菌在普通的HE染色片上不易辨认，多种特殊染色方法有助于组织中真菌的观察。银染色、Gridley’s　fungus、PAS是观察真菌最常用的三种染色方法。其中PAS的效果最好。在临床上应对同一标本同时做HE染色和特殊染色。

五、血清学诊断

深部真菌感染患者往往有免疫受损的基础疾病、病情严重，而传统的培养方法耗时、阳性率低。这延误了诊断和治疗的最佳时机。因此，寻找深部真菌感染的快速诊断方法成为目前医学真菌学研究领域的热点。隐球菌乳胶凝集试验已在临床上广泛应用。近几年，检测真菌代谢产物的β－1，3－D－葡聚糖半乳糖（G试验）和甘露聚糖（GM试验）也已在临床广泛应用，同时也已有商品化试剂盒供应。学者们也正在寻找检测其他真菌代谢产物作为早期诊断的可能性。分子生物学诊断方法也已有了大量的研究，但由于难以标准化，所以仍未批准应用于临床。

（一）隐球菌乳胶凝集试验

隐球菌乳胶凝集试验是检测隐球菌荚膜多糖抗原成分，该方法已在临床应用将近40年，也是目前快速诊断真菌感染最成熟、最有价值、应用最广的血清学方法，其敏感性可达到99%。但类风湿因子、恶性肿瘤可造成假阳性；毛孢子菌与隐球菌的荚膜多糖有相似性，会产生交叉反应。

（二）β－1，3－D－葡聚糖检测

由于β－1，3－D－葡聚糖能特异性激活一种海洋生物鲎的G因子，因此β－1，3－D－葡聚糖检测方法又称G试验（G　test）。β－1，3－D－葡聚糖［（1，3）beta－D－glucans］广泛存在于各类真菌的细胞壁中，占真菌胞壁成分的50%以上。除结合菌和隐球菌外，其他真菌胞壁上都含有β－1，3－D－葡聚糖，以酵母菌含量为最高，而其他微生物、动物及人的细胞成分和细胞外液都不含这种成分。因此，G试验除了可检测念珠菌、曲霉外，还可用于检测一些少见真菌，如镰孢菌、毛孢子菌和支顶孢菌等，但隐球菌和接合菌感染者G试验阴性。由于β－1，3－D－葡聚糖广泛存在于真菌的细胞壁中，当真菌进入血液或深部组织后，β－1，3－D－葡聚糖可从胞壁中释放出来，进入血循环，并通过血液循环进入其他体液中，如尿液、脑脊液、腹水、胸腔积液等。在浅部真菌感染中，β－1，3－D－葡聚糖不释放入血，故其在体液中含量不增高。该试验的敏感性和特异性分别为67%～100%和84%～100%。血液透析、肝硬化、应用抗癌药物及再次手术的患者可出现假阳性结果。β－1，3－D－葡聚糖检测现已有成品试剂盒出售，由于其具有快速、简便的特点，临床应用也越来越广泛。

（三）GM试验

半乳糖甘露聚糖（galactomanna，GM）是曲霉生长时释放到循环中的一种细胞壁的多糖成分。因此，GM试验主要用于侵袭性曲霉感染的早期诊断。乳胶凝集反应、放射性免疫测定和酶联免疫吸附试验可测定的最小浓度分别为15ng／ml、10ng／ml和5ng／ml。

GM试验的主要作用是侵袭性曲霉病的早期诊断。标本可以是血清、支气管肺泡灌洗液、尿液。GM在侵袭性曲霉病早期即可在血清中被检出，甚至此时并未出现临床表现。同种异体干细胞移植术后肺部感染侵袭性曲霉病时，通过GM诊断侵袭性曲霉病的平均时间比胸部X线透视诊断早8天，比高分辨率CT诊断早6天，比标本培养分离出曲霉诊断侵袭性曲霉病早9天。总的来说，与采用组织病理学检查和标本培养诊断侵袭性曲霉病来比较，应用GM诊断侵袭性曲霉病平均要早14天。对高危的血液病患者，每天监测GM并进行临床评估，I值连续2次≥0．5有临床意义。最近一项荟萃分析总结了血清GM（Platelia　Bio—Rad）在诊断侵袭性曲霉病中的应用价值。该项分析共收集27份GM试验的文献，共4　000余例患者。确诊加拟诊病例中，GM试验的灵敏度为0．61，特异度为0．93。GM试验在各份研究的不同患者群中的诊断价值不同，血液系统恶性病患者中发生曲霉感染者较多，测试阳性的可能性较高，GM试验的诊断价值也较好；而实体器官移植受者发生曲霉感染者较少，测试阳性的可能性较低，GM试验的诊断价值逊色于血液系统恶性病患者。

GM试验还用于侵袭性曲霉病患者疗效的检测。血清GM浓度会随着侵袭性曲霉病的进展而增加，也会随着抗真菌治疗的有效而下降。

GM试验的假阳性主要是一些抗原物质与单克隆抗体产生交叉反应所致。①哌拉西林－三唑巴坦是一种针对中性粒细胞减少症患者发热的重要抗生素，而应用哌拉西林－三唑巴坦会显著增加假阳性数量。某些细胞毒性药物也可以引起假阳性。②患者临床状态很差时会有胃肠道黏膜的损伤，导致胃肠道中的成分包括曲霉渗透进入血液中，与抗体产生交叉反应。③胃肠外营养，当患者由静脉供给营养时，营养液中的某些成分会和单克隆抗体产生交叉反应。④青霉感染也可以引起假阳性，HIV阳性的马尔尼菲青霉病患者GM阳性率达73．3%。⑤血液透析可能引起假阳性反应。

曲霉感染局限未侵入血管、侵袭性曲霉病患者产生高滴度抗体以及曲霉释放出微量GM都是GM检测产生假阴性的原因。也有研究证明，预防性应用两性霉素B和伊曲康唑会抑制菌丝的生长，也会造成假阴性的产生。检测阈值由1．0降低到0．5有助于减少假阴性的发生。

（四）其他

甘露聚醇（mannito1）广泛存在于真菌细胞壁中，尤其念珠菌属含量丰富；烯醇化酶是糖酵解所必需的胞内酶，念珠菌感染时大量释放；D阿拉伯糖醇（D－arabinito1）是大多数念珠菌属在宿主体内、体外的主要代谢产物；以上检测用于念珠菌感染的诊断，但这些方法不够成熟，未广泛推广使用。

六、分子生物学诊断

分子生物学方法诊断真菌感染是近年来真菌学领域研究的热点。分子生物学诊断方法众多，在实验研究阶段也取得了较为满意的结果，由于很难标准化，所以未能在临床推广使用。另外，临床上得到的标本中真菌核酸含量低，这也是困扰真菌感染分子诊断不能在临床很好应用的主要原因之一。各大公司也把真菌核酸提取方法作为试剂盒的开发重点。需要注意的是，环境中存在的大量孢子易造成检测样本或诊断试剂污染，而出现假阳性，应注意严格的实验室检测规范以及设置对照。

（一）普通PCR

普通PCR技术是基本的分子生物学诊断手段的基础。由于普通PCR敏感性差，很少直接用于真菌感染诊断。用于诊断的方法多是在普通PCR基础上派生出来的PCR方法。确定真菌感染的第一步可根据真菌的保守序列设计通用引物，用常规PCR方法进行扩增；扩增的靶基因常选择18s、28srDNA，比较成熟的引物有NS1、NS3、NS5、NS6、NS9等。若判定感染真菌的种类则需应用属种特异性引物，靶基因序列多选择转录间隔间区（ITS）或根据属种间的高变区来设计，常用引物有ITS1、ITS2、ITS3、ITS4等。

（二）巢式PCR

巢式PCR在普通PCR的基础上发展而来，其敏感性比普通PCR要高1　000倍。

（三）实时荧光定量PCR（real－time　PCR）

实时荧光定量PCR技术即在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。实时PCR技术在不断完善和发展，可以快速、灵敏、定量诊断侵袭性真菌感染。

（四）DNA探针技术

DNA探针是能识别特异核苷酸序列的带标记的一小段DNA分子，其检测的原理是分子杂交。随着分子生物学技术的发展，DNA探针技术和其他技术相接合形成了一些新的分子生物学诊断方法。