定量杀菌试验

定量杀菌试验（quantatitive bactericidal test），目的是定量地鉴定消毒方法在规定条件下的杀菌效果。定量杀菌试验法分为载体定量杀菌试验法和悬液定量杀菌试验法，分别鉴定载体上和悬液内污染微生物的杀灭效果，确定该消毒方法消毒使用剂量，结果可用杀灭率、杀灭对数值、杀菌指数或D值表示，为过度现场实验或实际应用提供依据。

（一）悬液定量杀菌试验

【器材和试剂】

实验中所用设备和无菌器材均为微生物实验室通用器材；主要试剂有：配制消毒剂所使用的蒸馏水、标准硬水；配制试验菌悬液所用PBS、蛋白胨溶液、中和剂溶液等；培养液为普通细菌所用的营养培养液和真菌试验所用的沙氏培养液等（附录一）。试验用指标菌均应使用《消毒技术规范》规定的标准菌株，在应用试验中也可观察对临床分离菌株的杀灭效果。规定的试验指标菌：金黄色葡萄球菌（ATCC　6538），大肠杆菌（8099），铜绿假单胞菌（ATCC　15442），白色葡萄球菌（8032），枯草杆菌黑色变种（ATCC　9372）芽孢，龟分枝杆菌脓肿亚种（ATCC　93326），白色念珠菌（ATCC　10231），黑曲真菌（ATCC 16404）。

【设计】

根据杀菌因子种类，化学消毒剂研究应设计有效浓度和无效浓度2个浓度组，每个浓度应设计3个时间组，每组时间之间间隔至少1.5倍，最短作用时间不少于30s，组间距离通过预备试验确定。在这些剂量组范围内应得到无效剂量数据、有效剂量数据和上限组即杀灭率达到100%数据。试验组设计应包括杀菌试验组（各剂量组）、阳性对照组即试验过程各标本不接触消毒剂，细菌生长不受影响和阴性对照组即对各种无菌试验溶液和培养液进行培养，应无菌生长。试验涉及到其他因素对照也必须设计，所有因素对照必须反应到结果中，以确认试验结果的有效性。

【操作步骤】

1.在有机干扰物（脏）下试验

（1）菌悬液制备：试验菌悬液培养制备方法请参照本章第二节相应细菌种类描述的方法进行。

（2）试验标本制备：首先将本次试验所需菌悬液加入到1支无菌大号试管内，再加入倍量有机干扰物（含30g／L小牛血清白蛋白溶液）混匀，配制成含菌量为1×107cfu／～5×107cfu／ml试验菌悬液。再用无菌硬水将待测消毒剂配制成试验浓度的1.25倍试验消毒液。阳性对照用稀释液或中和剂溶液，稀释液通常用含5g／L吐温-80的PBS或胰蛋白胨生理盐水。

（3）菌药混合：以每管4.0ml的量将试验消毒液分装到排好的（2组浓度、3组时间）各组无菌试管内（同时加好阳性对照管），置于（20±2）℃水浴中5min恒温；然后按试验顺序在含消毒液试管内加入1.0ml试验菌悬液，立即混匀计时。

（4）作用后清除残余消毒剂：待作用至规定时间，取出0.5ml菌药混合液，加到盛有4.5ml中和剂试管内，混合均匀，中和作用10min。

（5）活菌计数培养：将中和作用后的样液经充分混匀，取0.5～1.0ml样液接种平皿，1式2份，倒入融化冷却至50℃的营养琼脂。将阳性对照做系列10倍稀释，取最低稀释度样液0.5ml接种平皿，1式2份，倒入营养琼脂。待所有营养琼脂都冷却后，一并置于37℃培养箱内培养48h，对每个平板上菌落数分别记录，每个平板上菌落数在30～300cfu为活菌计数有效。试验至少重复3次。

2.低浓度加有机干扰物（清洁）试验

（1）菌悬液制备：试验菌悬液培养制备方法请参照本章第二节相应细菌种类描述的方法进行。

（2）试验标本制备：取足够本次试验用量的制备好的菌悬液与含3g／L小牛血清白蛋白溶液作对倍稀释配制试验浓度菌悬液；用无菌标准硬水将待测消毒剂配制成试验浓度的1.25倍试验消毒液。阳性对照用稀释液或中和剂溶液，稀释液通常用含5g／L吐温－80的PBS或胰蛋白胨生理盐水。

余下试验程序与有机干扰物条件下试验完全相同。

【计算】

1.细菌总数

平板平均菌落数＝

例如，2个平板菌落数分别为98cfu和102cfu。

3.平均杀灭对数值　平均杀灭对数值＝阳性对照平均菌数的对数值－试验组平均存活菌数的对数值（log）

（二）载体定量杀菌试验

【试验准备】

1.菌悬液与染菌载体制备　请参照本章第二节“染菌载体制作”方法执行。

2.试验标本制备　准备好试验用染菌载体，若从冰箱内取出需要在室温下至少放10min；用无菌标准硬水配制好试验浓度消毒液。

【操作步骤】

1.标本恒温　取2个无菌平皿（直径45mm左右），分别标明消毒剂的2个浓度，再分别加入相应浓度的消毒剂20ml（按每个染菌载体5ml用量）；阳性对照平皿内加入

细菌总数＝平板平均菌落数×稀释度

例如，平板平均菌落数为100cfu，稀释度为10－4。

细菌总数＝100×10　000＝1　000万cfu／ml）

2.平均杀灭率

平均杀灭率（%）＝20ml稀释液或中和剂溶液，一并置于（20± 2）℃水浴中平衡温度。

2.加入染菌载体　用无菌镊子取制备好的菌片将染菌面朝上轻轻放入消毒液内使其完全浸没在消毒液内，每个平皿以时间次序可放4个菌片，立即计时。

3.清除残余消毒剂　作用至规定时间，立即用无菌镊子依次将菌片取出，每片放入1支含有5ml中和剂的试管内，即刻振荡混合，中和作用10min。

4.接种培养　将中和作用后的试管内菌片经充分振荡洗脱，取0.5ml洗脱样液接种无菌平皿，1式2份，倒入熔化的营养琼脂培养液。阳性对照经充分振荡洗脱后，做系列10倍稀释，取最低稀释度样液接种平皿，1式2份，倒入熔化的营养琼脂培养液。待凝固后，一并置于37℃培养48h，记录平板菌落数。

【计算】

除菌数以平均每片细菌总数表示之外，余下与悬液定量法完全相同。