细菌繁殖体悬液

（一）细菌（含真菌）悬液制备

在消毒效果考核和消毒试验及消毒监测中经常会使用人工染菌法，人工染菌必须使用细菌纯培养物（pure cultre of bacteria）制备的菌悬液或用菌悬液来制作染菌载体，因此，这首先需要培养制备细菌（含真菌）悬液。

【制备方法】

选择合适的指标菌种。在选择消毒方法时，首先要考虑用消毒标准试验菌株，根据消毒对象来确定。我国《消毒技术规范》采用国际通用标准菌株，细菌繁殖体代表菌株有金黄色葡萄球菌ATCC　6538代表革兰阳性化脓性致病菌、铜绿假单胞菌ATCC　15442代表医院感染致病菌，大肠埃希菌8099代表肠道致病菌，白色葡萄球菌8032代表空气中污染菌，龟分枝杆菌脓肿亚种（ATCC　16404）代表分枝杆菌，白色念珠菌ATCC　10231代表真菌酵母菌。临床实践中也可根据需要观察医院感染临床分离出的强抗力致病菌株作为试验菌株。

【培养液和特殊器材】

普通细菌繁殖体使用普通营养琼脂培养液和普通营养肉汤（见附录A）。白色念珠菌等真菌用沙堡偌琼脂培养液及其肉汤培养液（见附录A）。灭菌PBS，10g／L蛋白胨PBS，细菌实验室常用试剂；过滤漏斗，灭菌脱脂棉，恒温水浴箱，离心机及其他微生物实验室常用无菌器材。

【操作步骤】

1.增菌培养　在无菌操作条件下，用碘酊乙醇棉球消毒冷冻菌种管尖部外壁然后打开，用无菌毛细管吸取少量营养肉汤（白色念珠菌用沙氏肉汤，下同）加入菌种管内溶化并混匀，吸取少量菌种悬液接种到含5ml营养肉汤管内，置于37℃温箱内培养24h，即为增菌培养物。

2.分离纯化培养　用接种环取增菌培养物在营养琼脂培养液（白色念珠菌用沙氏琼脂培养液）平板上做分区划线分离，于37℃温箱内培养24h，部分形成典型单个菌落。

3.选取典型菌落接种　用接种环挑取单个典型菌落用划线接种法接种营养琼脂斜面，于37℃温箱内培养24h，即成为第3代纯培养物。

4.制备菌悬液　取第3～14代（自第3代开始每转种一次即增加一代）新鲜斜面培养物，用5ml无菌吸管吸取5ml PBS加入到斜面试管内，用吹吸法洗下斜面上菌苔，多吹吸几次然后吸出，经过一薄层无菌脱脂棉过滤到另一无菌试管内，敲打100次，用标准比浊管比浊测定细菌含量，根据需要加入适量10g／L蛋白胨PBS配制成适当浓度的菌悬液即可使用。消毒试验常用细菌含量为106～108／ml，最好当天制备当天使用，冰箱储存一般不超过3d。

（二）分枝杆菌悬液制备

试验菌株为龟分枝杆菌脓肿亚种（ATCC　16404）。打开冷冻菌种管，取样接种罗肉汤管，于37℃培养24h；用接种环取培养物划线接种固体培养液分离单个菌落，于37℃培养24h；选取典型单个菌落接种固体培养液斜面，于37℃培养24h，用稀释液洗下菌苔并配制试验浓度菌悬液。同时选取单个菌落接种多个斜面作为保存使用，每日均应使用新鲜培养物进行试验。

（三）霉菌悬液制备

以黑曲霉菌（ATCC　16404）为例：打开冷冻菌种管，取少量菌粉液接种到麦芽浸膏营养肉汤管内，置于30℃培养24～48h；用接种环取样划线接种MEA培养液平板上，分离单个菌落，置于30℃培养24～48h；选取单个典型菌落接种到麦芽浸膏营养琼脂斜面，置于30℃培养24～48h；作为保存试验。

试验时，取新鲜培养的斜面，用5ml麦芽浸膏营养肉汤洗下斜面上菌苔，振打均匀，接种含有MEA培养液的罗氏瓶，置于30℃培养7～9d形成黑曲霉孢子。用5～10ml含500mg／L吐温-80生理盐水注入罗氏瓶洗下酶菌孢子，将黑曲霉孢子悬液收入无菌三角瓶内。振摇1min，除去菌丝，经过滤。然后将其经5　000r／min，离心20min，镜检不存在菌丝即可使用。