药用植物种苗快速繁殖（组培快繁）

【目的要求】　植物组织培养技术是生物技术的重要组成部分，在生产实践及基因工程、遗传转化等研究中有重要的应用前景。植物脱毒及离体快繁、花药培养与单倍体育种、幼胚培养与试管受精、抗性突变体的筛选与体细胞无性系变异、植物产品的工厂化生产等方面的研究和应用，均必须借助植物组织培养技术的基本程序和方法。目前，利用植物组织培养技术进行药用植物种苗快速繁殖在药用植物种植中应用相对比较广泛。

通过本实验，要求同学掌握植物组织培养操作技术、了解外植体脱分化及再生的过程、理解植物细胞全能性、了解药用植物种苗快速繁殖方法。

【实验原理】　快速繁殖就是利用各种生物技术，在短时期内繁殖出大量新植物体的技术。通常采用组织培养的方式进行快速繁殖。所谓植物组织培养（Plant Tissue Culture）是把植物的器官、组织以至单个细胞，应用无菌操作使其在人工条件下能够继续生长，甚至分化发育成一个完整植株的过程。其理论基础为植物细胞的全能性与植物的再生作用。细胞是生物有机体的基本结构单位；细胞是在生理、发育上具有潜在全能性的功能单位。具有生命力的植物体细胞，即使是单独状态，如果置于适当条件下，使最小单位的生命力进行分裂和增殖，这个体细胞也具有发育成一个植物体的潜在能力，这就是1902年德国著名的植物学家Haberlandt提出的“植物细胞全能性”学说。实质上，植物的组织在培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，又能重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化作用”。已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。植物激素在此过程中起着重要的作用，对某些植物而言，吲哚乙酸和6－苄基氨基酸嘌呤的比例，决定了根和芽的分化。

近百年来，植物细胞和组织培养技术有了迅猛的发展。用组织培养方法在人工控制的环境里，可以周年不断地缩短植物形态建成和个体发育的周期，大量繁殖植株的数量。快繁对于按照植物在自然状态下的生命周期和繁殖系数进行的常规的生产可以说是一种革命性的突破。工厂化试管苗快繁技术将成为21世纪重要的农业产业，它在药用植物中的应用也将越来越广泛。

【实验材料与仪器设备】

1．试材　桔梗Platycodon grandiflorum（Jacq．）DC．、莪术Curcuma zedoaria（Christm）Rose．、淮山药D．batatas Decne．

2．实验室　准备室、接种室及培养室等。

3．用具　高压灭菌锅（器）、光照培养箱、振荡培养箱、天平、酸度计、超净工作台、镊子、解剖刀、剪刀、接种针、细菌过滤器、记号笔、移液管、三角瓶、培养瓶、培养皿、量筒及容量瓶、称量纸、牛皮纸、棉线等。

【实验内容与方法】

1．培养基的制备

（1）母液的配制：在植物组织培养中，不同的植物、不同的器官和组织、不同的研究目的，使用不同的培养基。培养基千差万别，按其性质和含量来分主要由以下几部分组成：无机营养（包括大量元素和微量元素）、有机物质、铁盐、糖类、天然复合物、激素、琼脂（固体培养基）、其他添加物。

在培养基的配制中，对各成分，常先按其需用量扩大一定倍数，配制成母液（表2－5）。

（2）培养基的配制和分装：根据培养基的成分及用量，吸取各种母液，称取蔗糖（一般用量3%），加水至所需体积，待蔗糖全部溶解后，用1mol／L的NaOH或HCl调酸度至pH5．8，加入琼脂粉（一般6．5～8g／L），加热使琼脂完全熔化，蒸馏水补齐溶液体积，分装在三角瓶或培养瓶中。

表2－5　MS培养基母液配制

（3）培养基灭菌：待培养基冷却凝固后，用一层称量纸和一层牛皮纸包扎瓶（管）口，并用棉线扎牢，然后在高压灭菌锅中121℃（1kg／cm2）下灭菌20min。取出三角烧瓶放在台子上，冷却后备用。接种操作所需要的一切用具（如长镊子、解剖刀、剪刀等）及灭菌水，需同时灭菌。

2．外植体取材、消毒及接种

（1）取材与消毒：自大田取材或温室取材时应选取无病、无虫、生长健康的外植体（包括根、茎、叶、芽等）。外植体表面消毒的一般程序为：外植体→自来水多次漂洗→消毒药处理→无菌水反复冲洗→无菌滤纸吸干。常用消毒药的种类、使用质量浓度及消毒时间等（表2－6）。

表2－6　常用消毒药的使用和效果

（2）无菌操作

①接种室消毒：接种室使用前需打扫清洁，先用5%甲醛（福尔马林）溶液喷雾灭菌，然后再用紫外灯光线灭菌30min以上。如用超净工作台接种也要用70%乙醇溶液擦台面消毒，打开紫外灯照射20min。在整个接种过程中，尽可能使环境保持无菌。

②材料的接种：操作人员接种前必须剪除指甲，并用肥皂水洗手，用70%乙醇溶液拭擦。接种时最好戴口罩，必须在近火焰处打开培养容器的瓶口，并使瓶倾斜（瓶口低，瓶底高），以免空气中的微生物落入瓶内。外植体接种的具体操作如下：左手拿试管或三角瓶，用右手轻轻取下包头纸；将试管或三角瓶的口靠近酒精灯火焰，瓶口略倾斜；这时将管口外部在灯焰上烧数秒钟，然后用右手的小指和环指配合手掌面慢慢取出棉塞或橡皮塞；将瓶口在灯焰上旋转灼烧，然后用镊子将外植体送入瓶中。外植体在培养容器内的分布要均匀，以保证要的营养面积和光照条件。镊子灼烧后放回支架或浸入消毒乙醇溶液中，这时将棉塞在火焰上旋转灼烧数秒钟，塞回瓶口。所有材料接种完毕，包扎好包头纸或封口膜，做好标记，注明接种植物和处理名称、接种日期。

3．无菌培养与观察　接种后将材料放入培养室或培养箱内培养，温度一般为（25±2）℃，光照10～16h，光强1　000～2　000lx，有的材料需要暗培养。定期观察，继代培养（或转接培养）。

【注意事项】

1．配制大量元素母液时，为了避免产生沉淀，各种化学物质必须充分溶解后才能混合，同时混合时要注意先后顺序，把钙离子（Ca2＋）、锰离子（Mn2＋）、钡离子（Ba2＋）和硫酸根（SO2－4）、磷酸根（PO3－4）错开，以免形成硫酸钙、磷酸钙等沉淀，并且各种成分要慢慢混合，边混合边搅拌。

2．配制母液时要用重蒸馏水等纯度较高的水。药品应用等级较高的化学纯及分析纯，以免带杂质对培养物造成不利影响。药品称量及定容都要准确，在称量时不同的化学药品需使用不同的角匙，以免药品的交叉污染与混杂。

3．各类激素要用量极微，其母液一般配制成0．1～1mg／ml。有些激素不溶于水，需经加热或用少量稀酸、稀碱及95%乙醇溶液溶解后再加水定容。常用激素类的溶解方法如下：

（1）萘乙酸（NAA）：先用热水或少量95%乙醇溶液溶解。

（2）吲哚乙酸（IBA）：先用少量95%乙醇溶液溶解后加水，如溶解不完全则加热。

（3）激动素（KT或KIN）：要先溶于1mol／L盐酸。

（4）6－苄基腺嘌呤（6－BA）：要先溶于1mol／L盐酸。

（5）玉米素（ZT或ZEA）：先溶于95%的乙醇溶液，再加热水。

（6）2，4－D：需用1mol／L NaOH溶解再定容。

4．激素溶液一般用微孔滤膜在超净工作台中过滤后备用。其往往是在培养基经灭菌后，温度稍降，再加入培养基中混匀然后进行分装的。

5．所有用作组织培养的玻璃器皿和用具都必须洁净和严格灭菌。

6．操作过程必须严格要求以防止污染。

【药用植物组织培养程序实例】

1．桔梗Platycodon grandiflorum（Jacq．）DC．上胚轴培养

（1）培养条件：基本培养基的MS培养基。

①诱导培养基：MS＋2，4－D　0．2mg／L

②继代培养基：MS＋BA　0．5mg／L＋NAA　0．05mg／L

③生根培养基：1／2MS＋NAA　0．5mg／L＋IAA　0．1mg／L

培养基含蔗糖30g／L、琼脂9g／L，pH5．8，培养温度为20～24℃，光照强度为1　000～1　500lx。光照时间每天为12～14h。

（2）消毒与接种：洗净种子，在无菌室内，用漂白粉过饱和溶液上清液浸泡15min，无菌水冲洗1～2次，70%乙醇溶液浸泡1～2s，无菌水冲洗2～3次，用0．05%HgCl2浸泡2～3min，无菌水冲洗5～8次，用消毒纸吸干表面水分，将种子接种入MS培养基，10～15d后，种子萌发，取其上胚轴接种入诱导培养基。

（3）诱导愈伤组织和芽分化：接种10d后，上胚轴开始膨大，长出浅绿色的愈伤组织。20 d后，生芽，并长出绿叶，长成无根从苗。

（4）继代培养：待苗长到5～6cm时，将苗分成2～3株的从苗，基部带愈伤组织，转接到继代培养基中，平均20～25d继代1次。

（5）生根培养及移栽：将长的健壮的苗分成单株，去除基部愈伤组织，接种于生根培养基中，10d后开始长根，待根达1～2cm时，打开瓶盖，置于温室下，炼苗2～3d后，取出小苗，洗去基部的培养基，移栽于腐殖土中，移入温室，保持温度。温度可控制在20～24℃，7d后移栽。

2．莪术Curcuma zedoaria（Christm）Rose．块茎上幼芽培养

（1）培养条件

①无菌外植体培养基：MS＋BA　0．5mg／L＋IAA　0．1mg／L

②愈伤组织诱导培养基：MS＋2，4－D　1．0mg／L＋KT　4．0mg／L

③愈伤组织继代培养基：MS＋2，4－D　1．0mg／L＋KT　0．5mg／L

④愈伤组织分化培养基：MS＋KT　4．0mg／L＋NAA0．2mg／L

⑤芽伸长培养基：MS＋KT　0．5mg／L＋IAA0．2mg／L＋GA0．02mg／L

⑥生根培养基：1／2MS＋KT0．5mg／L＋IAA　1．0mg／L＋蔗糖15g／L

培养基含蔗糖30g／L、琼脂5g／L，pH5．8，培养温度（22±2）℃，光照强度为2　000lx，光照时间10～12h／d。

（2）无菌外植体的获得：洗净莪术根茎，将莪术根茎上大约0．5cm的芽切下，于75%乙醇溶液中浸泡45s，再于0．1%HgCl2中消毒8min，无菌水冲洗5次，然后接种于无菌外植体培养基中培养。

（3）愈伤组织的诱导、继代与分化：选取较幼嫩的莪术试管苗基部接入愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织的诱导。将诱导出的愈伤组织于愈伤组织继代培养基上每25～30d继代1次。选取继代了2～3次生长旺盛、质地致密、表面有细颗粒状结构、颜色鲜黄的愈伤组织转入愈伤组织分化培养基中进行愈伤组织的分化培养。

（4）芽的伸长与生根培养：将在愈伤组织分化培养基中生长健壮的再生芽及在芽增殖培养基中生长了约1个月的丛生芽分成3～4个为一小簇转入到芽伸长培养基中进行芽的伸长培养。将在芽伸长培养基中生长了约1个月的芽再转入到芽生根培养基中进行生根培养。

（5）试管苗的移栽：在生根培养基中生长了约1个月的生长健壮的试管苗可以移栽，移栽时温度不可低于22℃，也不宜过高。移栽时将试管苗从瓶中取出，用清水将根表面的培养基冲净，然后移入经多次冲洗的较粗河沙中，于温室内培养。初期不能接受阳光直射，每2～3d浇透一次水，相对湿度保持在85%以上，8～10d后可适当提高光照强度和温度，再经约2周可移栽大田。

3．淮山药（D．batatas Decne．）带腋芽的茎段培养

（1）培养条件

①丛生芽诱导培养基：MS＋6－BA　3mg／L＋NAA　0．3mg／L

②生根培养基：1／2MS＋NAA　0．5mg／L＋0．2%药用炭

③微型薯培养基：MS＋KT　1mg／L＋NAA　0．02mg／L＋PP333　0．1mg／L＋0．2%药用炭

培养基含蔗糖30g／L、琼脂7．5g／L，pH5．8～6．0，121℃灭菌18min，培养温度24～28℃，光照强度为2　000lx，光照时间16h／d。

（2）外植体的建立：种薯切段经室内沙培长出的带芽茎段为外植体，在超净工作台上用75%乙醇溶液消毒30s后，放入0．1%HgCl2溶液中振荡10min、无菌水冲洗5次后，用刀切成1cm长的茎段接种于丛生芽诱导培养基中。

（3）丛生芽的诱导：外植体接种7d后，腋芽开始启动，继续培养20d，腋芽增殖为丛生芽，每隔25～30d转接1次，繁殖系数可达4．0。

（4）根的诱导：将丛生芽切成单个芽后，接种于生根培养基中，10d后苗基部分化出不定根，继续培养30d后，生根率达90%以上。

（5）微型薯的诱导：将生根后的小苗转入微型薯诱导培养基中，70d后苗根部有微型薯产生，继续培养150d，即可形成微型薯。

【思考题】

1．简述植物组织培养操作应注意的问题。

2．什么是植物细胞的全能性，什么是植物的再生性？

3．根据自己的实验统计外植体的污染率、诱导脱分化率和植株再生率。