苏木素－伊红染色

苏木素－伊红染色法（hematoxylin－eosin　staining，HE），是应用最广泛的组织病理学常规染色技术。

（一）染色液配制

★Harris苏木素液配制

【试剂】　苏木素1．0g，硫酸铝钾20g，氧化汞0．5g，无水乙醇10ml，蒸馏水200ml，冰醋酸8ml。

【方法】　先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木素再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，煮沸1min后，稍冷却，慢慢加入氧化汞0．5g，继续加热至染液变为深紫色，用纱布盖住瓶口，随即用冷水冷却，恢复至室温过滤备用。使用时再过滤后加入冰醋酸8ml。

★Mayer苏木素液改良配法

【试剂】

1．A液　苏木素2．0g，无水乙醇40ml。

2．B液　硫酸铝钾100g，蒸馏水600ml。

【方法】　稍加热使硫酸铝钾在水中溶解，将苏木素溶于无水乙醇中，再将A液与B液混合煮沸2min。用蒸馏水补足600ml，加入400mg碘酸钠充分混匀，苏木素染液呈紫红色。

★0．5%水溶伊红溶液配制

【试剂】　水溶伊红0．5～1．0g，蒸馏水100ml。

【方法】　先将水溶性伊红加入蒸馏水中，用玻璃棒搅拌至伊红搅起泡沫后过滤，每100ml加冰醋酸1滴即可。

★0．5%醇溶伊红液配制

【试剂】　醇溶伊红0．5～1．0g，95%乙醇100ml。

【方法】　先将伊红溶于乙醇中，用玻璃棒搅拌使伊红充分溶解后，每100ml加冰醋酸1滴。用醇溶伊红液染胞质后可不经水洗直接用95%乙醇脱水。

（二）染色

【基本步骤】

1．脱蜡　用二甲苯Ⅰ5～15min，然后用二甲苯Ⅱ5～15min，应达到完全脱蜡透明。

2．逐级降乙醇浓度水化

（1）无水乙醇Ⅰ（置换出二甲苯）1～3min。

（2）无水乙醇Ⅱ1～3min。

（3）95%乙醇1～3min。

（4）90%乙醇1～3min。

（5）85%乙醇1min。

（6）自来水洗1～2min。

3．着色

（1）苏木素液染核5～10min。

（2）自来水流水冲洗1min。

（3）1%盐酸乙醇分化1～20s。

（4）自来水流水冲洗1min。

（5）1%氨水返蓝5～20s。

（6）自来水流水冲洗或蒸馏水洗1～2min。

（7）0．5%伊红水溶液1～3min。

（8）自来水流水冲洗1～3s。

4．逐级升乙醇浓度脱水　若为醇溶伊红可直接入95%乙醇。

（1）80%乙醇1～3s。

（2）85%乙醇1～5s。

（3）90%乙醇30s。

（4）95%乙醇Ⅰ1～3min。

（5）95%乙醇Ⅱ1～3min。

（6）无水乙醇Ⅰ3～5min。

（7）无水乙醇Ⅱ3～5min。

5．透明处理

（1）苯酚－二甲苯3～5min。

（2）二甲苯Ⅰ3～5min。

（3）二甲苯Ⅱ3～5min。

（4）二甲苯Ⅲ3～5min。

6．封片　自二甲苯中取出染好的切片擦去周围的二甲苯，滴以适量的中性树胶，加盖盖玻片，盖玻片常从底边均匀推放，防止气泡。树胶多少适度不外溢。

【染色结果】　细胞核呈蓝色，胞质呈红色，红细胞呈橘红色，其他嗜伊红成分呈深浅不同红色，钙盐和各种微生物也可染成蓝色或紫蓝色。

【注意事项】　一张优质的HE染色切片观察起来色泽鲜艳、层次分明、结构清楚、易于辨认。但要制备一张优质切片如前所述必须保证组织的固定、脱水、透明、浸蜡，包埋和切片的各个环节符合标准要求。在此基础上注意HE染色时常遇到的问题：

（1）组织切片的脱蜡要彻底，否则，无论进行哪种染色都不会有理想的结果。要求脱蜡时间要充分，脱蜡剂使用过久应及时更换，若室温过低，可于温箱中进行脱蜡。

（2）用含有升汞液体固定的组织，其切片染色前应先行脱汞。

（3）固定时间长的组织要流水冲洗脱除甲醛色素或对切片进行脱色素。①石蜡切片脱蜡至水洗；②1%NaOH（1ml）与80%乙醇（99ml）混合液10min；③流水冲洗5min；④转入HE染色。

（4）苏木素染液使用一段时间后表面易出现亮晶状飘浮物，这可能是液体表面的过氧化物，必须过滤除去，以防沉渣污染组织切片。苏木素液一般染过300～400张切片后，着色力会减弱，着色不鲜艳，呈灰蓝色时应及时更换新液。

（5）染色的时间长短需依据染剂对组织的着色特点、室温条件、切片厚薄、固定液的类别、染液的新旧而进行调节。所以在染色时最好使用显微镜观察染色程度掌握时间。

（6）分化十分重要。分化步骤的准确也是染色成败的关键，若分化失当则必然引起染色不匀或过淡、过深等现象，因此分化后一定要镜检，观察胞核是否清晰，胞质呈淡白色。否则需再次分化，不然一旦复染后，组织会呈紫蓝色即“蓝盖红”现象。

（7）还原返蓝液不宜过浓，若碱性太强易使组织脱落故以淡为宜。

（8）伊红宜淡染，若过深可使胞核不清晰，影响观察。

（9）脱水、透明不彻底，组织表面会有一层雾状膜，应立即更换纯乙醇，退回重脱水。在潮湿的季节里应注意乙醇的浓度及时更换。

（10）染色后的组织切片要将组织四周的污染物痕迹擦掉，以免影响美观。

（11）载玻片自二甲苯中取出后，应立即用稠度适宜的中性树胶湿封载玻片，树胶要适量，盖玻片要轻轻放置，达到无气泡，无溢胶。盖玻片大小选择要合适、放正，标签清楚。不应将组织切片烤干或风干后再行封片，影响效果。

（12）染好的切片应妥为保存，更应避免日光照射，否则切片容易褪色。