线粒体肿胀和线粒体突变

(一)突变类型

图1-4　人类mtDNA结构

线粒体基因突变类型包括点突变、缺失、插入以及拷贝数目突变，其中点突变包括错义及蛋白质合成基因的突变。错义突变发生于mRNA相关的基因上，可导致多肽链合成过程中的错义突变，主要与脑脊髓性及神经性疾病有关，如Leber遗传性视神经病和神经肌病；蛋白质生物合成基因突变为tRNA基因突变，这类突变所致的疾病较错义突变所致疾病表现出更具系统性的临床特征，并与线粒体肌病相关，典型疾病包括有肌阵挛性癫伴破碎红纤维病(myoclonic epilepsy with ragged-red fibers，MERRF)、线粒体脑肌病伴乳酸中毒及卒中样发作(mitochondrial encephalomyopathy with lactic alidosis and serohe-lihe episodes，MELAS综合征)、母系遗传的肌病及心肌病；缺失突变主要引起绝大多数眼肌病，这类疾病多为散发而无家族史。mtDNA缺失发生的原因往往是由于mtDNA的异常重组或在复制过程中异常滑动所致，常发生于神经性疾病及一些退化性疾病中，如KSS综合征；插入突变在mtDNA中较为少见；拷贝数目突变为mtDNA拷贝数大大低于正常，可为常染色体显性或隐性遗传，提示该病由核基因缺陷所致线粒体功能障碍，这种突变较少，仅见于一些致死性婴儿呼吸障碍、乳酸中毒或肌肉、肝、肾衰竭的病例。

(二)致病mtDNA突变特点

由于缺乏组蛋白保护并且没有完整的突变修复功能，mtDNA突变率非常高。线粒体基因组的高突变率不但产生了大量的致病突变体，还产生了更多的序列多态性(如作为遗传学标记的单核苷酸多态性位点)。致病性mtDNA突变一般具有以下特点：①突变位点在进化上较为保守，突变导致核苷酸或氨基酸替换，或基因编码产物的生物学功能丧失；②突变导致的生化损伤和疾病的临床表型能够分离；③当突变是异质性突变时，组织损伤程度与突变负荷呈一定的正相关；④同一突变可以从遗传上相互独立的患者中发现。致病性mtDNA突变通常位于编码蛋白质、tRNAs或rRNAs的基因上，并能够引起广泛的临床症状。mtDNA突变与表型之间的关系复杂，同一mtDNA突变可以引发不同的疾病表型，例如，tRNA Leu(UUR)基因上的A3243G突变既能出现在线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作(MELAS综合征)患者中，也能出现在慢性进行性外眼肌麻痹(CPEO)、线粒体肌病、糖尿病伴耳聋患者中；另外，同一疾病表型也可以由不同的突变引起，例如，MELAS可以由20多个点突变(位于编码tRNAs或呼吸链复合体蛋白亚基的线粒体基因上)引起，也可以由重组突变引起。一些彼此独立的因素可以影响mtDNA疾病的临床表现，包括突变体的异质性水平、组织分布、器官对呼吸链的依赖程度、核背景和环境因素等。由于mtDNA突变致病的分子机制还没有被完全阐明，突变与疾病表型之间的确切关系至今仍显得扑朔迷离。

(三)与点突变相关的遗传性疾病

mtDNA点突变所引起的人类遗传性疾病主要有：Leber遗传性视神经病变(Leber′s heredieary optic neuropaehy，LHON)、线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作(MELAS)、肌阵挛性癫症和破碎红纤维病(MERRF)、神经性肌无力-共济失调-色素性视网膜炎(neuropaely ataria and retinitis pigmentosa，NARP)、母系遗传Leigh综合征(maternally inherited leighs syndrome，MILS)、母系遗传糖尿病伴耳聋(maternally inherited diabetes and deafness，MIDD)、氨基糖苷类诱导性耳聋或非综合征耳聋、心肌病和肌红蛋白尿等。此外，mtDNA点突变还与一些代谢疾病(如高血压病、糖尿病、高胆固醇血症等)和神经变性疾病(如帕金森症、阿尔茨海默症等)的易感性有关。

1.Leber遗传性视神经病变(LHON)　遗传性视神经病变是一种母系遗传性疾病，主要累及男性，常伴有家族史。发病年龄常在20～30岁，但最小可仅几岁，最大可达70多岁。双眼可同时或先后发病，受累眼视力可突然完全丧失，也可在2年内渐进性下降。最终视力预后因mtDNA突变位点不同而不同。11778A、3460A、14484C是目前公认的致病性最强的3种原发性突变。11778点突变的患者最严重，预后最差，最终视力可为无光感；3460点突变次之；14484点突变视力预后最好，而且37%～50%患者在16个月后恢复。但现在用更灵敏的仪器检测发现，许多11778点突变的患者也存在视功能的恢复。

另外，有些患者体内除了携带3种原发突变基因外还存在其他mtDNA位点的突变，如3394、4216、4019、5244、4777、9438、13708、15257、15812等，称为继发性突变。这些突变在正常人群中也可能存在，但频率远低于LHON患者。一般来说继发性突变多是纯合性的，必须与原发性突变同时存在才可致病。以往认为，继发性突变可以协助疾病表达，但现在发现这些突变并不损害患者体内的线粒体功能，因此推测它们只是人群中的多态位点。

由于LHON患者男女比例显著不同，有人猜测是否存在一连锁突变位点，对线粒体原发性突变有修饰作用。但现在许多实验并未发现X染色体存在易感基因。因而推测男性的一些特异性生理功能、解剖结构、生活习惯都可能是诱发其发病的因素。

核基因对视神经病变的发病可能也起到不容忽视的作用。在胞质杂合体转移试验中发现，在胞质杂合体中也存在复合物I活性降低，但降低程度较原发突变细胞轻，所以推论核基因在LHON发病中也发挥一定作用。

2.线粒体基因突变与糖尿病　线粒体基因突变糖尿病(mitochondrial diabetes mellitus，MDM)的发现是近年来糖尿病分子遗传学研究的重要进展之一，并成为糖尿病领域研究热点。1992年，Vanden Ouweland等报道了一个合并有糖尿病和耳聋的家系，同时存在母系遗传史，后证实其致病原因为线粒体DNA(mitochondriaDNA，mtDNA)3243A→G的突变，此病被称为母系遗传糖尿病伴耳聋综合征(maternally inherited diabetes and deafness syndrome，MIDD)，即线粒体基因突变糖尿病(MDM)。迄今，国内已报道30多个家系，100多例突变携带者。目前已知的突变位点有20多个，但mtDNA转移核糖核酸亮氨酸tRNA Leu(UUR)基因3243A→G点突变是最常见的突变点。

其他突变点：日本学者Kameoka等在mtDNA突变糖尿病的研究中，发现了线粒体tRNALys8296位点A→G突变，此位点突变是糖尿病的一个致病基因，该突变可以解释约1%的糖尿病病因。nt3394T→C突变频率在非胰岛素依赖型糖尿病患者群为2.4%～6.0%，该突变是同质性错义突变，属于轻度有害性突变，在其他高危因素的协同作用下，诱发糖尿病。纪立农等筛查716例非胰岛素依赖型糖尿病患者得出，nt3316G→A突变发生率为2.2%，认为该位点仅是mtDNA的多态性表现。国内研究较多的16189T→C突变在正常人群中的发生率为21%，多认为是糖尿病易感基因，与非胰岛素依赖型糖尿病的胰岛素抵抗相关，而不是单基因致病突变。

(四)重组突变

mtDNA重组突变是最早被报道与人类疾病相关的mtDNA突变。虽然发生重组突变的mtDNA片段长度可以从一个碱基变化到几千个碱基，但重组突变主要分为：大片段缺失和倍增。缺失突变可以单独存在于患者中，也能与倍增同时出现。最常见的一种重组突变是长度在5kb左右、跨越Cytb基因和CoxⅡ基因之间区域(包含tRNAs和蛋白质的编码基因)的单个大片段mtDNA缺失或倍增。这种大片段重组突变通常与一些典型的疾病表型有关，如Pearson综合征、Kearns-Sayre综合征(KSS)、慢性进行性外眼肌麻痹(CPEO)和Pearson骨髓-胰腺综合征。然而，重组突变并不局限于上述几种疾病表型，也能涉及糖尿病、听力丧失和几乎所有线粒体脑肌病。单个大片段的mtDNA重组突变可能形成于卵子发生时期或胚胎发育早期，与大片段缺失或倍增突变相关的疾病大多为散发性，且复发风险小，据Chinnery等报道患病妇女下一代的发病风险仅为4.11%。

(五)体细胞mtDNA突变在肿瘤中的作用

1.mtDNA突变与肿瘤的密切关系　研究显示不同组织发生的肿瘤其mtDNA突变位点不同，这可能是由于不同组织的肿瘤发生所必需的mtDNA突变率、线粒体数目和细胞分化固有数目存在差异。大体上，与实体肿瘤类型无关的mtDNA变化特点有两种：一是主要的突变为碱基替换从T→C和G→A；二是D-loop区似乎是一个体细胞突变的频发位点。

肿瘤细胞线粒体C-tract呈现的微卫星不稳定性(MSI)是目前mtDNA突变的研究热点。Nomoto等对19例肝细胞癌标本的检测显示，8/19(42%)C-tract缺失或插入突变和5/19(26%)其他的错义、插入或缺失突变，几乎都为同质性的突变。13/19患者的mtDNA突变不出现于相应的非肿瘤区域的D-loop区，证实突变的mtDNA在肿瘤细胞中具有优势。Habano等对结肠癌的研究得出类似结果，他认为同质性突变与肿瘤相关而且符合癌细胞的厌氧生存环境。Ha等的研究显示头颈部癌前病变存在mtDNA的MSI变化，其增加与疾病恶性进展呈正相关。

2.mtDNA突变与肿瘤诊断　Fliss等检测了人膀胱、头颈部和肺原发性恶性肿瘤的mtDNA序列，结果显示有高频的同质性突变，主要涉及D-loop区和ND4亚基。基于此，作者进一步分析了具有mtDNA突变患者的体液标本。结果显示，膀胱癌患者3份尿样中均检测出源于肿瘤的mtDNA突变；头颈部肿瘤患者唾液标本6/9中，肺癌患者支气管肺泡灌洗液样本8/10中均存在mtDNA突变。在同时具有p53基因突变的患者，mtDNA突变丰度为p53基因的10～200倍。因此，mtDNA突变可望成为有效的分子标记用于肿瘤早期诊断。

一项旨在利用mtDNA同质和异质性突变来鉴别肝细胞癌复发和肝脏第二次肿瘤发生的研究揭示，同一起源的肝肿瘤具有相同的mtDNA突变，不同的mtDNA突变意味着不同起源的肝肿瘤发生。如果原发性肿瘤中存在的mtDNA突变，第二次发生的肿瘤中未出现，则后者被认为是独立的病变。难确定克隆关系的是原发肿瘤无突变，而第二次发生的肿瘤存在突变，这或者是第二次发生的肿瘤具有克隆趋异性，因为突变可以发生于肿瘤的进展过程中；或者是独立发生的肿瘤。Nomoto等的实验结果显示只有1例与临床肿瘤转移的诊断不符，因为其具有不同的mtDNA突变。因此，mtDNA突变可以帮助确立克隆关系并为临床合理治疗复发或第二次发生肿瘤患者提供依据。该方法也可用于常规的肝穿刺标本。由于mtDNA突变的多态性和不同组织发生肿瘤的差别，利用mtDNA突变作为肿瘤特异性诊断应建立在mtDNA全序列测序和同时检测来自同一个体的正常和病变区域的mtDNA样本。

(六)体细胞mtDNA突变与衰老

人类衰老过程的一个重要特征，是伴随年龄增长出现的各种组织线粒体功能降低。呼吸链功能衰竭可能在衰老过程中起作用，伴随衰老，一些组织的状态与呼吸速率明显降低，组化检查也发现缺乏细胞色素氧化酶活性的肌肉纤维在老年人大量增多。Fayet等选取69～82岁没有肌肉疾病的个体来研究肌纤维中mtDNA突变情况，在8组细胞色素C氧化酶缺乏的肌纤维中检测到5个tRNA突变，而在正常组织中没有发现点突变；在7个细胞色素C氧化酶缺乏的个体和一个正常个体中检测到4个不同的大片段缺失。研究表明，尽管肌肉mtDNA突变总体水平较低，但突变的积累引起了线粒体功能的严重损失。

大多数伴有mtDNA缺失的疾病往往在成年期开始表现出来，且随着年龄的增长症状逐渐加重，缺失的mtDNA也渐进性增殖，提示随年龄增长可能伴有特异的mtDNA缺失。这种突变累积的结果，使线粒体氧化磷酸化的能力逐渐降低，细胞产生的ATP越来越少，表现出来的症状越来越明显。老年人各组织的mtDNA存有12处以上的大片段缺失，其中以4977bp和7346bp的缺失最常见。这种随年龄增长而明显增加的缺失只聚积在老化的有丝分裂后的细胞内，在40～80岁年龄段随年龄增长呈指数增加。Roberto等在年老的骨骼肌中发现，D环中存在2个点突变，对来源于91个不同年龄、不同个体的活体组织中的这两个突变的发生率和异质水平进行了评价，发现突变随着年龄增加而显著积累。在碱基缺失的患者组中存在较高的突变，而且有证据表明多碱基缺失的患者mtDNA突变的风险有增加趋势。mtDNA突变随年龄的增长而增多，使mtDNA基因组高突变率常作为衰老过程的潜力生物学标记。

1988年，有研究者首次证实线粒体疾病与线粒体突变之间的关系。在随后的10余年间，研究者又发现许多与衰老相关的退行性疾病的主要原因是mtDNA的变异。与此相关的衰老性疾病包括阿尔茨海默症、帕金森综合征等。阿尔茨海默症是一种大脑疾病，5%～10%的65岁以上的人会患这种疾病，这种疾病与损害神经细胞的毒性蛋白质-－β淀粉体在大脑中的堆积有关。β淀粉体进入线粒体并与那里产生的一种酶相互作用，损害了线粒体，使一种损害整个神经细胞的物质泄漏，造成神经细胞的死亡，导致记忆的丧失和其他阿尔茨海默症状的出现。Valente等对一组欧洲家族的基因分析时发现了在PINKI基因上的变异，该基因编码一种位于线粒体上的蛋白质，他们假设，正常PINKI基因也许会保护神经细胞免遭线粒体功能障碍和细胞死亡。

大量研究证实正常个体也会出现mtDNA突变，并且随增龄而积累。对于mtDNA突变和衰老之间关系的研究主要是利用PCR、 SSCP等方法纵向或横向比较体细胞mtDNA突变积累和年龄增长的关系，而mtDNA突变在人类衰老中的确切作用和机制还有待于深入探讨。