基因芯片的原位合成

（一）核酸的变性

DNA的变性是指在某些理化因素的作用下，DNA双链被解开成为单链的过程。RNA分子内的局部双螺旋也可解链而变性。核酸变性的实质是维系DNA双螺旋的氢键遭到破坏，而一级结构是完整的。加热、酸、碱、尿素和酰胺等都能引起核酸变性。随着核酸的变性，其理化性质也会随之发生改变，如A260值增大（增色效应）、溶液黏度下降、浮力密度升高及正旋光性降低等。加热是实验室中最常采用的DNA变性的手段，称之为热变性。以温度为横坐标，以A260值为纵坐标，可绘制出融解曲线或解链曲线（图2－11）。

图2－11　DNA解链曲线

DNA的热变性就像结晶体的熔点一样是爆发式的，只发生在很窄的温度范围内。通常将A260值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度（melting temperature，Tm），此时，DNA分子内部有一半的双链解体。Tm值的大小与DNA的碱基组成有关，A＋T的比例越高，Tm值越小。反之，Tm值越大。换句话说，Tm值与DNA分子中G＋C含量成正比。DNA的Tm值一般在70～85℃。

（二）核酸的复性

DNA的变性是可逆的。DNA的复性是指去除变性因素后，变性的DNA可重新形成双链而恢复天然结构的过程。最佳的复性温度是比Tm值低约25℃。热变性的DNA经温度缓慢下降而复性的过程称之为退火。值得注意的是，热变性的DNA退火时，温度不能骤然下降到4℃以下，此时不能发生复性。实验室工作中，利用这一特性来保持变性DNA的单链状态。

（三）核酸分子杂交

核酸分子中存在某些碱基互补区。不同来源的热变性后的单链DNA与DNA（或RNA）之间可形成双链杂交体，这个过程称之为核酸分子杂交（图2－12）。

图2－12　核酸分子杂交示意图

无论何种类型的杂交，其本质都不外乎DNA－DNA或DNA－RNA杂交。建立在核酸变性与复性原理基础上的分子杂交是分子生物学的重要技术之一，可用于鉴定核酸序列的相似程度、基因定位、鉴定重组DNA，也是基因诊断的一种手段。

（四）基因芯片

20世纪末出现了一项崭新的生物信息规模化分析技术－生物芯片技术，它包括基因芯片（gene chip）和蛋白质芯片（protein chip）。生物芯片技术综合了物理学、化学、分子生物学及计算机科学等学科的相关技术。

基因芯片包括DNA芯片和cDNA芯片。DNA芯片早期被称做DNA微列阵（DNA microarray）。基因芯片是采用光导化学合成和照相平板印刷技术，在硅片或玻片表面合成成千上万个有规律排列的特定的DNA或cDNA探针，然后与荧光标记的待检测核酸样品杂交，利用激光共聚焦荧光系统对杂交后的芯片进行扫描，通过计算机系统检测各探针位点荧光信号的强弱和分布，对结果作出分析、比较和判定。基因芯片的基本原理是分子杂交，基因芯片与常规分子杂交的不同之处在于固定探针，标记待检测核酸。基因芯片可应用于基因组做图、基因克隆测序、基因突变分析、基因表达分析、基因多态性分析、新基因发现和基因诊断等方面。

（田余祥）