提取方法的选择

15．1．3　SOD提取方法的选择

除在体液中直接提取酶外，一般都要选用适当的方法，将含目的酶的生物组织破碎，促使酶溶解，最大程度地提高抽提液中酶的浓度。SOD在血液中的提取比较简单，只要离心获得红细胞，经溶血后即可实施有效提取，而在植物或微生物中就困难多了。下面所列的一些提取方法可供选择。

15．1．3．1　生物材料的破碎

各种生物组织的细胞有着不同的特点，在考虑破碎方法时，要根据细胞性质和处理量，采用合适的方法。表15－1列出了常用的细胞破碎方法。

表15－1　细胞破碎方法

（1）机械（匀浆）法。利用机械力的搅拌，剪切、研碎细胞。常用的有高速组织捣碎机（Waring blender）、高压匀浆泵（国外称Manton－Gaulin）、玻璃或Teflon研棒匀浆器（国外称Potter－Elvehiem homogeniver）、高速球磨机或直接用研钵研磨等。动物组织的细胞器不甚坚固、极易匀浆，一般可将组织剪切成小块，再用匀浆器或高速组织捣碎器将其匀质化。匀浆器一次处理容量约50mL，高速组织捣碎器容量可达500～1　000mL左右。高压匀浆泵非常适合于细菌、真菌（如酵母）的破碎，且处理容量大，一次可处理几升悬浮液，一般循环2～3次，足以达到破碎要求。

（2）超声波法。超声波是破碎细胞或细胞器的一种有效手段。经过足够时间的超声波处理，细菌和酵母细胞都能得到很好的破碎。若在细胞悬浮液中加入玻璃珠，时间可更短些，一般线粒体经过125W超声处理5min后即可全部崩解。超声波破碎一次处理的量较大，探头式超声器的超声效果比水浴式超声器更佳。超声处理的主要问题是超声空穴局部过热会引起酶活性丧失，所以超声振荡每次处理的时间应尽可能短，并在容器周围用冰浴冷却处理，以降低热效应引起的酶的失活。

（3）冻融法。生物组织经冰冻后，细胞胞液会结成冰晶，使细胞壁胀破。冻融法所需设备简单，普通家用冰箱的冷冻室即可进行冻融。该法简单易行，但效率不高，需反复几次才能达到预期的破壁效果。如果冻融操作时间过长，更应注意胞内蛋白酶作用所引起的后果。一般需在冻融液中加入蛋白酶抑制剂，如PMSF（苯甲酰磺酰氟）、配合剂EDTA、还原剂DTT（二硫苏糖醇）等以防破坏目的酶。

（4）渗透压法。渗透破碎是破碎细胞最温和的方法之一。细胞在低渗透溶液中由于渗透压的作用，溶胀破碎，如红血球在纯水中会发生破壁溶血现象。但这种方法对具有坚韧的多糖细胞壁的细胞，如植物、细菌和霉菌不太适用，除非用其他方法先除去这些细胞外层坚韧的细胞壁。

（5）酶解法。利用溶菌酶、蛋白水解酶、糖苷酶对细胞膜或细胞壁的酶解作用，使细胞崩解破碎。将革兰氏阳性菌（如枯草杆菌）一起温育，也可制得相应的原生质体。酶法常与其他破碎方法联合使用，如在大肠杆菌冻融液中加入溶菌酶就可大大提高破碎效果。

15．1．3．2　提取方法的选择

破碎生物组织一般在适当的缓冲液中进行。典型的抽提液由以下几部分组成：

细胞胞液的离子强度应控制在0．3mol/L左右，所以通常都用0．3mol/L的蔗糖溶液或0．15mol/L的KCl溶液抽提，但对SOD影响较大，故应改用离子强度低于0．01mol/L的KCl或NaCl抽提。抽提时为防止过冷、过热引起的酶分子变性失活，可加入适量的二甲基亚砜、甘油加以保护。此外，重金属离子影响和氧化失活作用（如酶的活性中心有巯基等）明显时，也应考虑去除。

评价分离提纯方法好坏的指标有两个：一是总活性的回收率；二是比活提高的倍数。总活性的回收率，反映了提纯过程酶活性的损失情况，而比活的提高则反映了纯化方法的效率。纯化后比活性提高越多，总活性损失越少，则纯化效果就越好。实际上，纯化倍数与回收率不可能两者兼顾，应根据具体情况作相应取舍。

McCord与Fridovich首次纯化了牛红细胞SOD。在纯化过程中详细记录了每项实验步骤样品液的总体积、总蛋白酶活性与产率，详见表15－2。

表15－2　牛红细胞SOD的纯化^[1]

酶经过纯化后，最终比活性达3　300u/mg蛋白，纯化倍数为2　750，产率为60%，可见此纯化工艺优质可行。