同工酶的研究和应用

12．4．2　SOD同工酶的研究和应用

用电泳方法研究SOD同工酶最早见于Beauchamp等用Disc－PAGE技术对SOD进行电泳分析，以后陆续有许多报道。根据SOD抑制NBT光化还原的原理，Fridovich用动物组织进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）及活性染色方法应用于SOD的同工酶研究。我国王爱国、罗广华等人较早建立了SOD凝胶电泳及活性染色方法，并对大豆和花生种子SOD同工酶进行了研究。实验表明，大豆种子有7～8条谱带，花生种子有5条谱带，其中电泳迁移率最低的一条是Mn－SOD，其余都是Cu，Zn－SOD。邹国林等人也用同样的方法研究了小白菜SOD同工酶，发现小白菜5条同工酶谱带中，4条是Cu，Zn－SOD，1条是Mn－SOD。金建丽采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的方法对牡丹江鲶鱼血清蛋白及心、肝、肾、肌肉、脑、胃6种组织SOD同工酶进行分析发现，鲶鱼血清蛋白共分离出21条带；鲶鱼6种组织的SOD同工酶共分离出25条带，其中心脏为9条带，肝脏为11条带，肾脏为8条带，肌肉组织为14条带，脑组织为10条带，胃组织为13条带。颜伟玉等利用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳方法，以莲花花粉、芝麻花粉和茶花花粉为材料，采用SOD抑制NBT在光照下的还原作用原理，对这3种花粉中的SOD同工酶进行分离及活性染色。结果表明：莲花花粉的SOD同工酶具有2条清晰透明的活性谱带；芝麻花粉的SOD同工酶也具有1条清晰透明的活性谱带；而茶花花粉的SOD同工酶却没有清晰透明的活性谱带。

等电点聚焦电泳法能更灵敏地检测SOD同工酶。Beauchamp等将聚焦后的凝胶浸在2．45mmol/L NBT中20min，接着在含28mmol/L四甲基乙二胺、0．028mmol/L核黄素、36mmol/L硫酸钾的pH为7．8的缓冲液中浸泡15min，然后在紫外光下照射10min，胶变成蓝色，而后SOD处出现白色沉淀带。通过这种方法，测得牛肝含有7条Cu，Zn－SOD带，2条Mn－SOD带；鸡肝中含有8条Cu，Zn－SOD带，3条Mn－SOD带；鼠肝含有4条，鼠脑含有5条Cu，Zn－SOD带。

肖用森等报道金樱子肉Cu，Zn－SOD经PAGE电泳、NBT染色，出现5条同工酶谱带，其中最明显3条的迁移率为0．43、0．46和0．55。从种子粗提液的SOD同工酶谱上可以清楚看到，大豆种子有7条同工酶谱带，决明和玉米种子各5条，而且大豆、决明有3条同工酶谱带的R_f值是一致的，其亮度也基本相同，但玉米的同工酶谱带与它们的差别较大，见图12－3。

图12－3　大豆、决明和玉米种子的超氧化物歧化酶同工酶谱

（引自李金亭，等．河南师范大学学报（自然科学版），2002）

Sabeh等报道芦荟（Aloe vera）SOD有5条Cu，Zn－SOD同工酶谱带，2条Mn－SOD同工酶谱带。有人以小鼠为实验材料，发现其红细胞有6条Cu，Zn－SOD同工酶谱带，心肝肺分别为2、4、3条，可见不仅种与种间有差别，即使同一物种的不同组织其同工酶谱带也不尽相同。母昌考等以口虾蛄为材料，用PAGE对其肌肉、心脏、腹腮、肝胰腺及眼球5种组织器官进行SOD同工酶的研究，结果表明不同组织中SOD的同工酶谱带存在差异，SOD同工酶的分布具有明显的组织特异性，其中眼球、腹腮、肝胰腺和心脏中有2条带，肌肉中几乎不表达，心脏中SOD2和肝胰腺中SOD1谱带表达最浓，而腹腮中的酶带表达最弱，见图12－4。

图12－4　口虾蛄SOD组织特异性图谱

M—肌肉（muscle）；He—肝胰腺（hepatopancresa）；E—眼睛（eye）；G—腹腮（ventral gill）；H—心脏（heart）

（引自母昌考，等．海洋湖沼通报，2003）

活性氧自由基与肿瘤发生、发展的关系是一个复杂而有争议的研究课题。在生理情况下，需氧生物体内既有自由基生成，同时机体亦存在有效的抗自由基防御体系，使自由基的产生与清除处于动态平衡。任何原因导致自由基产生过多和（或）清除体系不力，均可致自由基净水平增加，进而引发体内脂质过氧化的连锁反应，产生过氧化脂质及其降解产物丙二醛（malondialdehyde，MDA），后者是致突变剂。SOD是氧自由基的天然酶类清除剂和自由基连锁反应的阻断剂。人体内有Cu，Zn－SOD和Mn－SOD两种同工酶，SOD活性的大小可直接影响体内氧自由基的净水平及其引发的脂质过氧化速率。

王明臣等探索了人膀胱癌组织中SOD同工酶的表达状态及其生物学意义。他们选取经过病理学证实的人膀胱癌组织及邻近癌旁组织，并以非膀胱癌患者的膀胱黏膜组织作为对照，分别用硫代巴比妥酸法和亚硝酸盐法测定组织中的MDA含量、SOD同工酶（Cu，Zn－SOD、Mn－SOD）活性。研究发现，按照正常膀胱黏膜组织—癌旁组织—癌组织的发生发展过程，组织中MDA含量依次显著升高，而SOD同工酶活性（尤其Mn－SOD活性）依次显著下降，且随肿瘤临床分期和病理分级的递增而分别升高和降低，表明膀胱癌的发生发展与组织中氧化应激的亢奋及抗氧化酶活性的损伤密切相关，且这一变化早于组织学变化。他们又进一步分析了SOD同工酶活性及含量在食管癌和癌前增生患者中的变化。在尽可能控制各组受试对象条件均衡的前提下，综合同步测定了食管癌发生、发展过程中机体SOD活性和含量的变化趋势以及反映机体氧化应激状态的血清MDA水平。结果表明，随食管上皮细胞病变级别增加，血清总SOD活性呈明显降低趋势，且主要表现为Cu，Zn－SOD活性的显著下降，MDA水平亦显著升高。对同批对象进行血清Cu，Zn－SOD的定量测定以追踪其活性下降的原因。结果显示，与Cu，Zn－SOD活性逐渐降低的变化趋势相反，随病变的发展血清Cu，Zn－SOD含量反而显著升高，提示食管癌及癌前增生宿主Cu，Zn－SOD活性的降低并非酶合成量的不足，而系无活性或功能缺陷的Cu，Zn－SOD的存在。