时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluoroisnmunoassay,TRFIA)是近10年发展起来的一种微量分析方法,与其他免疫分析技术相比,有独特的优点,克服了RIA中放射性核素带来的污染和EIA中酶不稳定的缺点,而且TRFIA法能很好地消除背景荧光的干扰,使其灵敏度比普通荧光法高出几个数量级,成为免疫分析中最有发展潜力的分析方法。
TRFIA实际上是在荧光分析(FIA)的基础上发展起来的一种特殊荧光分析。利用荧光波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外-可见分光分析法中杂色光的影响,同时,荧光分析与普通分光不同,光电接受器与激发光不在同一直线上,激发光不能直接到达光电接受器,从而大幅度提高了光学分析的灵敏度。但是,在进行超微量分析时,激发光杂散光的影响十分严重。因此,解决激发光杂散光的影响成了提高灵敏度的瓶颈。解决杂散光影响的最好方法是测量时没有激发光的存在,但普通的标志物荧光寿命非常短,激发光消失,荧光也消失。但稀土金属(Eu、Tb、Sm、Dy)的荧光寿命较长,可达1~2ms,能够满足测量要求,因此产生了时间分辨荧光分析法,即使用长效荧光标记物,在关闭激发光后再测定荧光强度。常用的稀土金属主要是Eu(铕)和Tb(铽)。
时间分辨荧光免疫分析的原理是:用三价稀土离子及其螯合剂(如Eu3+)作为标记物,标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞,待与反应体系(如抗原抗体、生物素亲和素、核酸探针杂交、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等)发生作用后,用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度,判断反应体系中被测物质的含量。主要用于测定各种激素、蛋白质、酶、药物、肿瘤标记物等。
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