不应期的测定及其影响因素

实验一　神经干动作电位传导速度、不应期的测定及其影响因素

实验目的

（1）学习神经干兴奋传导速度的测定方法，加深对兴奋传导概念的理解。

（2）学习不应期的测定方法，了解神经干动作电位的产生及兴奋性表现的规律性变化。

实验原理

神经干受到有效刺激兴奋以后，产生的动作电位以脉冲的形式按一定的速度向远处扩布传导。不同类型的神经纤维其传导兴奋的速度是各不相同的，主要取决于神经纤维直径、有无髓鞘、环境温度等因素。总体来说，直径粗的纤维传导速度快，直径相同的有髓纤维比无髓纤维传导快。神经冲动在神经纤维上的传导速度（v）是指动作电位在单位时间（t）内传导的距离（Δs），可根据动作电位在神经干上从一点传导到另一点所需要的时间来计算，计算公式如下：

v＝Δs／t（m／s）

蛙类的坐骨神经干属于混合性神经，其中包含有粗细不等的各种纤维，其直径一般为3～29μm，直径最粗的有髓纤维为A类纤维，传导速度在正常室温下为35～40 m／s。

神经的兴奋性表现为神经细胞膜的去极化和复极化。神经在一次兴奋后，其兴奋性在发生周期性的变化后才能恢复正常，该周期性变化可分为4个时期，即绝对不应期、相对不应期、超常期和低常期。Na^＋通道在去极化时大量开放，其失活的出现较其他离子通道快，而且只有当去极化消除后，通道才可能解除失活。因此，可兴奋组织在接受一次刺激后的极短时间，即相当于在此刺激引起峰电位的时间内，不能接受新的刺激，故不可能发生两次峰电位的叠加，这一时期称为绝对不应期。之后，一些失活的Na^＋通道逐渐开始恢复，只有一些较正常时更强的刺激才能引起新的兴奋，这一时期即为相对不应期。通过调节双刺激之间的时间间隔，可测定坐骨神经的不应期。当双刺激间的时间间隔较大时，可以观察到两个同样大小的动作电位。当逐渐缩短双刺激之间的间隔时，第二个动作电位逐渐向第一个动作电位靠近，振幅也随之降低，最后可因落在第一个动作电位的绝对不应期内而完全消失。本次实验中所给条件性刺激和检验性刺激为两个参数完全相同的刺激。

实验对象

蟾蜍。

实验器材与药品

BL－420生物信号采集与处理系统、常用两栖类手术器械、蛙板、铁架台、张力换能器、神经屏蔽盒、固定针、培养皿、玻璃分针、刺激线、引导线、纱布、任氏液。

实验步骤

1．制备蟾蜍坐骨神经干标本

1）破坏脑脊髓

取蟾蜍一只，用探针法捣毁脊髓。此时蟾蜍下颌呼吸运动应消失，四肢松软，否则需重新进行捣毁。

2）去掉躯干上部及腹腔内脏

用大剪刀将蟾蜍耳后腺后缘水平位的脊柱剪断，左手持手术镊提起剪开的脊柱后端，右手用手术剪沿脊柱两侧剪开腹壁的皮肤与肌肉，注意勿损伤骶髂神经丛，使蟾蜍头及内脏自然下垂，剪除全部躯干上部及内脏组织弃于污物盘内。

3）剥除后肢皮肤

避开神经，用左手持镊子夹住脊柱断端，右手用镊子或直接用手捏住断端皮肤边缘，逐步向下牵拉剥离皮肤，拉至大腿时，如阻力较大，可先剥下一侧，再剥另一侧。将全部皮肤剥除后，将剥干净的后肢标本置于盛有任氏液的培养皿中。洗净双手及手术器械上的污物。

4）分离两腿

沿耻骨联合中央，用大剪刀将脊柱剪成左右两半（为保证两侧坐骨神经完整，应避免剪时偏向一侧），将已分离的两侧标本放入培养皿中，用浸过任氏液的棉花或纱布覆盖，保持湿度。

5）游离坐骨神经

（1）确定坐骨神经位置。取一侧后肢标本，在脊椎下段外侧可以看到下部脊神经，这些脊神经中最粗的就是坐骨神经，其走向大腿部。伸展大腿，从背面可以看到一条黑色的血管，与其伴行的便是坐骨神经。在大腿基部，坐骨神经位于坐骨神经沟内，即股二头肌和半膜肌之间。

（2）游离坐骨神经。先用玻璃分针沿脊柱侧游离坐骨神经腹腔部分，将未与脊神经相连的椎骨片剪掉，轻轻提起与脊神经相连的一小段椎骨片，剪断神经分支。然后将标本腹位固定于干净蛙板上，用玻璃分针沿坐骨神经沟纵向分离、暴露坐骨神经的大腿部分，一直游离到膝关节，自上而下剪断所有坐骨神经分支。沿股骨的方向剪掉大腿全部肌肉，刮干净股骨。在股骨中部剪断，至少保留1cm，断面呈斜截面。将剥离出来的坐骨神经干标本浸入盛有任氏液的培养皿中待用。

（3）标本活性检测。以手术镊轻轻提起标本的脊柱骨片，用经任氏液湿润的锌铜弓刺激神经。若腓肠肌迅速发生收缩反应，说明标本功能良好，制备成功。

2．连接实验装置

（1）按图4－1连接神经标本盒与BL－420生物信号采集与处理系统的连线。

图4－1　观察神经干动作电位及测定神经冲动传导速度装置图

（2）标本屏蔽盒内衬以浸湿林格液的滤纸，以增加盒内空气湿度，防止神经干迅速干燥。

（3）将神经干标本放置在刺激电极、接地电极和引导电极上。

（4）打开计算机，启动BL－420生物信号采集与处理系统。

实验观察项目

1．计算神经冲动传导速度

将标本屏蔽盒的刺激电极与BL－420生物信号采集与处理系统主机刺激输出线相连，引导电极1与通道1相连，引导电极2与通道2相连，接地电极连接地线。神经干中枢端置于刺激电极处，外周端接触引导电极，保持接地良好，引导电极的正、负极之间神经尽量长些，用刺激电压1．2V、波宽0．1ms的方波刺激神经干，通道1、通道2会各出现一个动作电位。计算两个动作电位起始点之间的时间差t，测量屏蔽盒中两引导电极之间的距离Δs，利用公式v＝Δs／t（m／s）计算神经冲动的传导速度。将神经置于4℃任氏液中浸泡后，再观察其传导速度的变化。

2．不应期测定（图4－2）

点击BL－420系统菜单“实验项目”，选择“肌肉－神经实验”子菜单“神经干动作电位不应期的测定”。给予神经干最大刺激强度，逐步改变刺激间隔时间，随着双脉冲时间间隔的缩短，逐渐缩短两个刺激方波之间的间隔，可见第二个动作电位向第一个动作电位逐渐靠近。当第二个动作电位幅值开始减小时，记下刺激间隔（T₂）；继续缩短刺激间隔直至第二个动作电位消失，记下此时的刺激间隔（T1），动作电位开始至T1为绝对不应期，T1至T2大致为相对不应期。

图4－2　坐骨神经不应期的测定

注：上线为动作电位；下线为刺激标记。

注意事项

（1）剥制神经标本时要仔细，避免与金属接触和损伤神经。有损伤的神经不能使用，它会产生损伤电位，干扰实验。

（2）神经标本必须与各电极良好接触。

（3）神经干在空气中不可暴露过久，屏蔽盒内放入润湿纱布，以保持盒内湿润，防止标本干燥，切勿向盒内直接滴加任氏液。

（4）神经干要伸直，防止弯曲、折叠和贴附，以免影响测量神经干长度的准确性。

（5）引导电极间距离应尽可能大，距离越远，测定的传导速度越准确。

（6）用恰好能使神经干产生最大动作电位的最大刺激强度刺激神经。

（7）盖上屏蔽盒的盒盖并接地，防止干扰。

（8）尽量减小动作电位的刺激伪迹，这样更加容易确定动作电位离开基线的起始点。

思考题

1．为什么两对引导电极相距越远，测定出的神经纤维兴奋传导速度就越准确？

2．假如某神经的绝对不应期为2ms，那么这一神经每秒钟内最多可以发放多少次神经冲动？

（张绪东　郑学芝）