分枝杆菌的代谢和生长

第六章　分枝杆菌的代谢和生长

一、分枝杆菌的代谢生物合成

多数的分枝杆菌为原养型细菌，即其在仅含有无机盐及碳源的培养基中即可生长。有时亦可发现有天然存在娇嫩的营养缺陷菌株，作为一种典型的细菌，分枝杆菌能抑制环境中存在营养物质的合成。虽然有关分枝杆菌的代谢所知不多，但同其他细菌一样，它们也可使用代谢阻抑和反馈抑制机制，如已证实嘧啶和脂肪酸内源性合成的抑制，并且已受到广泛的重视。

1.嘧啶　外源性嘧啶能在体外阻抑缓慢生长的分枝杆菌中嘧啶途径，而在体内生长的细菌则含有嘧啶生物合成的酶类，但不能合成嘧啶。提示在体内有大量的嘧啶受到抑制而被消失，但并不能阻抑此种途径。

2.嘌呤　致病性分枝杆菌中的嘌呤生物合成并不因外源性嘌呤而被阻抑，而诸如腺苷激酶之类的清除酶类则受到很强地诱导。麻风分枝杆菌不能合成嘌呤环，故必须由宿主体内获取嘌呤，主要是腺苷。这点与嘌呤营养缺陷型细菌鼠伤寒沙门菌截然不同，在体内不能清除足够量的嘌呤以满足其需要。这种差别的根本原因在于这两类细菌生长速度的差异。

3.类脂　分枝杆菌的脂肪酸合酶较之其他细菌更类似于脊椎动物，是一种含有磷酸泛酰巯基乙胺（phosphopantetheine），并且完成整个2－C加入循环的分子量为500×10³的复合体。结核分枝杆菌的酶是一种二聚体。很可能是头－尾基因复制，再继之以分散后的产物，因为两个亚单位具有不同的功能；其中的一个亚单位可以由丙二酸单酰辅酶A（Co A）合成C₁₆链，而另一亚单位则将其延伸至C₂₆。这种脂肪酸合酶与大小相似的mycoserosic acid无关，后者可由甲基丙二酸单酰辅酶A产生长链的甲基化脂肪酸。鸟分枝杆菌在体外生长时，C₁₆合成活性在有类脂存在的情况下受到阻抑，而且在体内时也受到阻抑；但是在此情况下C₂₆合成活性（“延伸酶”）却被诱导。在麻风分枝杆菌中，脂肪酸“延伸酶”的活性不足以满足细菌生长时的需要。这些结果提示麻风分枝杆菌有内在性的缺陷，而不是酶的调节缺陷。田鼠分枝杆菌（Mycobacterium microti）能由14 C－丙酸盐合成phenolphthiocerol dimycoserosate，并可在体外糖基化以形成杀真菌剂B（mycocide B），后者为田鼠分枝杆菌的酚醛糖脂。金色分枝杆菌提取物中由14 C－乙酸盐无细胞合成C₆₀至C₉₀分枝酸得以完成，事实上涉及最少包括一个需要生物素的羰基酶多酶复合体。根据刺激环化腺苷一磷酸盐（c A MP）磷酸二酯酶活性的能力，在结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌和草分枝杆菌中已鉴定出类似钙调蛋白的蛋白质，并已证实与磷脂的合成有关。葡萄糖的补加可在与此种类似钙调蛋白增加的同时刺激磷脂的合成。曾克隆出编码鸟－细胞内分枝杆菌（Mycobacterium avium－intracellulare）的复合抗原糖肽脂中单糖成分合成的DN A片段，并可将其转移至耻垢分枝杆菌，这种单糖成分在耻垢分枝杆菌中被加入内源性脂肽核心，赋予鸟－细胞内分枝杆菌复合体的抗原性。此种结果将使分析这一重要抗原的基因和生化合成途径成为可能。

4.多胺　多胺是分枝杆菌的重要组分，其合成与调节是一般生物合成过程的一项重要方面。鸟氨酸脱羧酶是多胺途径中所发现的第一个酶，有关此酶在分枝杆菌中作用的研究获得不常见的结果。这种酶一般受到蛋白质性质的酶类抑制物的调节。在耻垢分枝杆菌中的抑制物为RNA。这可能是能特异地抑制酶类的RNA中的第一实例。

5.类胡萝卜素　最近已将类胡萝卜素途径克隆成11kb片段，这一片段能赋予耻垢分枝杆菌以及金色分枝杆菌无色菌株色素形成特性。这一途径的分析将为分枝杆菌操纵子的结构和调节提供信息。

6.中间代谢　分枝杆菌中间代谢的典型循环与其他真细菌并无明显的差异。鸟分枝杆菌复合体的多位点酶的电泳分析研究为分枝杆菌中间代谢中的酶类提供了代表性的事实依据。20种不同的酶在所有进行分析的10个菌种中都有存在。例如，柠檬酸盐合酶通过补充了大肠埃希菌的gltA突变株以后，得以从耻垢分枝杆菌和麻风分枝杆菌中克隆。分枝杆菌酶与原核细胞及真核细胞柠檬酸盐合成酶同源。

7.维生素　耻垢分枝杆菌对甲氧苄啶（TMP）耐药的实验室菌株的主要差异为其二氢叶酸还原酶的纯化酶K1值较之敏感菌株有6倍的增加，因为是一种实验室诱导菌株，其临床意义如何，尚待确定。

8.其他生物合成活性　近年来在分枝杆菌的其他生物合成活性的研究中已获得了长足的进展。通过补助大肠埃希菌营养缺陷型的能力，已可克隆出许多基因。克隆出的分枝杆菌基因与其他细菌的相应酶的预期产物表现一定的序列相似性，而且活性一般表现超越菌种间的平行性。与分枝杆菌密切相关的细菌，如棒状杆菌之间的序列相似性极强。但分枝杆菌酶与其他菌种间的相似性并不一定反映推定的种系发育相互关系。表6－1中列出分枝杆菌的克隆生物合成基因及其他基因。

表6－1　分枝杆菌的克隆化生物合成基因及其他基因

在结核分枝杆菌和牛型分枝杆菌BCG中的基因传递研究中发现，克隆化分枝杆菌序列再次插入同源部位者仅占整个整合过程的10%以下；而随机非同源性（非常规）插入者则可占90%以上。这种在高等真核细胞中常见的非常规重组在其他细菌中并未发现。由于可引起随机营养缺陷型突变，故可成为进行结核分枝杆菌基因分析的有用工具，不过要形成同源性置换尚有很大的困难。在耻垢分枝杆菌中，非常规插入极为少见，提示在缓慢生长和快速生长分枝杆菌的基因功能之间存在甚为重要的差异。

二、营养和营养物的同化

（一）一般分解代谢

多数的分枝杆菌虽可在简单碳源加无机盐的情况下生长，但在合成性培养基中的适宜生长必须以天冬酰胺或谷氨酰胺作为氮源，甘油作为碳源。由于天冬酰胺和天冬氨酸在正常血清中含量较高，故可作为体内的重要氮源。分枝杆菌中氮的分解代谢途径与其他细菌一样，也应当受到良好地调节。例如，天冬氨酸在氮源受限制时可为耻垢分枝杆菌所利用以合成其他的氨基酸；而当氮源丰富时则可氧化成为二氧化碳。由高丝氨酸脱氢酶作用于天冬氨酸而产生的外高丝氨酸（external homoserine）可通过阻止谷氨酸的摄入而阻碍当谷氨酸作为唯一氮源时耻垢分枝杆菌的生长。由于在多数情况下高丝氨酸并不丰富，所以这一观察只能视作耻垢分枝杆菌所特有者。

分枝杆菌尚可如同其他细菌一样，通过可诱导途径来利用许多其他营养物作为碳和能量的来源。在包括麻风分枝杆菌在内的缓慢生长分枝杆菌中，已鉴定出可诱导性脂肪酸β^－氧化途径，其可能的基质为十二烷酸盐。在鸟分枝杆菌和田鼠分枝杆菌中则发现有可诱导性磷脂酶，可由磷脂酰胆碱的1和2位置上释放脂肪酸。这些脂肪酸可再被上述的β^－氧化途径所氧化。曾有报告在耻垢分枝杆菌中有一可诱导性D－阿拉伯糖补救途径，能将D－阿拉伯糖转变成为木酮糖（xylulose），后者再提供至戊糖磷酸盐途径。多年前即已获知非典型性分枝杆菌能在石蜡油作为唯一的碳源的情况下生长，而结核分枝杆菌则不能。近年来利用这一特点来区分鸟－细胞内分枝杆菌（可以利用石蜡）和结核分枝杆菌。

（二）特殊功能

分枝杆菌在环境生态系统中的作用所知不多。近年来有关土壤中自由生活分枝杆菌的合成及降解过程已有不少的报告。这些过程与土壤中假单胞菌的各种有机化学反应相似。例如，分枝杆菌由胆固醇合成许多类固醇激素，且具有一定的商业上的应用价值。各种碳氢化合物和有机化合物多可发生降解，而且这些活性可用作为环境污染的控制，如偶发分枝杆菌的芳香性脱卤酶（dehalogenase）。

这类活性的基因基础多数尚有待证实，有一尚未鉴定分枝杆菌所引起的Morpholine降解过程是由质粒编码的，这是分枝杆菌中所发现的第一个天然存在的质粒标记物。分枝杆菌的另一特殊功能为β^－内酰胺酶和汞还原酶。这些酶在其他细菌中广泛存在，且一般与质粒和转座子有关。β^－内酰胺酶分布极广，在分枝杆菌中也是普遍存在，并且与β^－内酰胺类抗生素的耐药性有关。在多数的分枝杆菌中，β^－内酰胺酶多存在于细胞内，只有在细胞裂解后才释出。因为β^－内酰胺不能穿过细菌细胞膜，所以细胞内存在的β^－内酰胺酶只有在细胞自溶后方可表现其在耐药性形成上的作用。必须注意，所有其他细菌的β^－内酰胺酶都可分泌至细胞外，因而很有可能分枝杆菌的β^－内酰胺酶也可分泌，而且是与细胞壁相连接的。

近年来尚在快速生长的汞抵抗性（Hg^r）分枝杆菌中证实了汞离子的还原。除了耻垢分枝杆菌以外，所有的Hg^r菌株都可将汞离子还原成初级汞，而且对有机汞化合物有抵抗力，使其与典型的金黄色葡萄球菌Hg^r菌株相似。这些细菌也可能含有有机汞溶解酶。有两株耻垢分枝杆菌分离物虽为Hg^r菌株，但并不含有汞还原酶，且对有机汞化合物敏感。Hg^r基因与分枝杆菌中常见的bla基因不同，是可变性的，出现于任何一种菌种0～83%的分离物之中。可见Hg^r是分枝杆菌的一种可变性特性，因而可能与转座子或质粒有关。

（三）铁的代谢

铁的代谢在分枝杆菌的发病机制上至关重要。但分枝杆菌对待铁质与其他细菌有所不同。但与其他细菌一致的是，分枝杆菌对于缺铁的反应是合成和分泌能移动和螯合外部铁质的铁载体（siderophores），或者合成数种与重新获得铁－铁载体复合体有关的膜蛋白。与多数其他细菌不同的是，分枝杆菌对于过量铁质以及低量铁质所诱发的反应是合成几种膜蛋白。此外，所有的分枝杆菌都需要有结合于细胞的铁储存化合物，称为分枝菌素（mycobactin），它是含有铁螯合物的复杂化合物，在铁缺少细胞中的含量只占整个细胞质量的5%～10%。有一菌种副结核分枝杆菌（Mycobacterium paratuberculosis）不产生分枝菌素，体外生长时须由外界供应分枝菌素。很可能分枝菌素本身，而不仅是其所携带的铁质，由细菌所摄取。副结核分枝杆菌在低pH情况下无分枝菌素存在时亦可生长，这可能是因为铁质在低pH时与其他螯合物的结合不牢固，因而可在无分枝菌素存在的情况下被使用。副结核分枝杆菌虽不能合成分枝菌素，但具有所必需的基因途径，因为可以分离出能产生分枝菌素的突变菌株。麻风分枝杆菌也不能产生分枝菌素，也可在吞噬溶酶体中低pH的基础下旁路分枝菌素的需要。其摄取铁质能力微弱，也是其明显的缓慢生长速率原因之一。

三、分子生物学

分枝杆菌DNA的G＋C含量在60%～70%之间，与链霉菌属、棒状杆菌属、细球菌属和节细菌属大致相似。分枝杆菌基因一般克隆至具有大肠埃希菌启动子的表达载体。虽然目前只有少数几个分枝杆菌启动子已获定位，但麻风分枝杆菌的16S核糖体RNA（rRNA），_－10和－35六核苷酸与大肠埃希菌共有序列配合良好。如下所示：

（TTGACA）　　　　　　（TATAAT）σ－70共有序列

TTGATCCCTCTGCTGGATCTGTATTAAT；麻风分枝杆菌18SRNA启动子

－35　　　　　　　　　　　　　－10

事实上这一启动子在大肠埃希菌和枯草杆菌中都可起作用。所以无必要另立一类分枝杆菌所特有的启动子。现已确认了分枝杆菌的转译信号，不过只有少数经N－末端测序得以鉴定，很多推定的起始信号与其他革兰阳性细菌相比较是极为可信的。表6－2中列出一些推定的分枝杆菌基因转译起始序列。如同其他的革兰阳性细菌一样，SD序列与16S核糖体3′互补性较之革兰阴性细菌更为相配合；但SD部位与起始密码子之间的距离平均为7个核苷酸（nt），属于革兰阴性菌的类型，而不同于其他革兰阳性细菌，其平均数为9～10。

表6－2　分枝杆菌中的转译信号

除了一个例外以外，所有克隆的分枝杆菌基因在其结构上都与典型的细菌性基因相似。这个例外就是结核分枝杆菌rec A。它虽与其他细菌性rec A基因同源，但另含有一额外的1 320 nt，从而使其能有一预期分子量为80×10³的基因产物。成熟的结核分枝杆菌Rec A蛋白的大小（分子量约42×10³）则与其他Rec A蛋白相同，表明已发生处理过程。因为额外DN A维持rec A读框，而且缺少剪接信号，所以不大可能这是一种内含子。另有一种可能性，那就是整个基因被转译，然后蛋白质被处理以剪掉额外片段。对于上述的问题，目前尚未解决，因为至今只有少数分枝杆菌基因已测序完毕。也不大可能rec A就是唯一能表现这种现象者，而且只有在这一方面表现与其他细菌间的根本性的不同。

原核细胞和真核细胞中最为保守的蛋白质当数热休克蛋白（HSP），其中包括侣伴蛋白（chaperonin）。分枝杆菌也不例外。而且这种保守性也有利于这些蛋白质的克隆化和分析，这些蛋白质又往往代表免疫保护性抗原。它们原始并不分泌。其他蛋白质的分泌是侣伴蛋白的一项重要功能，因此分枝杆菌预期必须具备标准的细菌分泌机制，包括N－末端信号肽的去除。在分枝杆菌培养物的上清液中确可测出有蛋白质。而有一情况可以说明真正的分泌，而不是由于自溶后蛋白质的释出。即细胞内抗原的分子量为26×10³，而分泌型分子量为22×10³，这是与信号处理过程一致的。

四、全局调节子

所谓全局调节是指多个分属不同代谢途径的操纵子受控于同一调节物。可能在分枝杆菌中也与其他细菌一样具有全局调节子，以此来控制对DNA损伤（SOS）、氧化应激、热休克的应答，对毒力因子的表达以及其他应答。

（一）热休克应答

很多HSP的分枝杆菌同源物已克隆和测序（参见表6－2），而且发现在系统发育程序中与其他细菌相应类似物是相配合的，提示它们之间具有功能平行性。此外，还有些HSP，特别是大小为65×10³的HSP，已证实为免疫优势抗原。Patel等证实牛型分枝杆菌的HSP可因热力的协调诱导而形成，而且其应答的主要组成是在转录水平上。Wetzstein等由包括分枝杆菌在内的许多菌种的dnaK基因5′端区域中鉴定出一可能的热休克应答元件。

（二）毒力决定簇及其调节

Arruda等克隆出分枝杆菌的基因片段，这一片段能使大肠埃希菌获得侵入哺乳动物细胞，并在巨噬细胞中生存的能力。Gupta和Tyagi鉴定能编码与毒力调节有关蛋白质的分枝杆菌基因，但这一基因在结核分枝杆菌中的确切功能尚待确定。Kinger等利用mRNA扣除杂交法（subtractive hybridization）在有毒力、无毒力的H37Rv和H37Ra配对间分离出许多可能的毒力基因。很有可能突变发生于调节基因，或毒力的全面调节子。

（三）氧化应激

与两个熟知的氧化应激酶有关的基因都已克隆，即超氧化物歧化酶（SOD）和触酶基因，这些基因曾在多种分枝杆菌中加以分析，并发现了与以往所观察的一些氧化应激酶之间有超越系统发育程式的高度相似性。在鸟－细胞内分枝杆菌的细胞提取物和培养上清液中都可鉴定出有铁－SOD和锰－SOD存在。提示SOD可能是被分泌出来的，分枝杆菌触酶－过氧化物酶katG曾吸引了广泛的注意是由于其在异烟肼－耐药结核分枝杆菌菌株中的缺失和突变。这种基因曾在结核分枝杆菌和细胞内分枝杆菌中进行克隆和测序，并发现与其他细菌性触酶－过氧化物酶同源。至今尚未对一般性的氧化应激进行分析。

五、分枝杆菌的生长速率

致病性分枝杆菌的显著特点为其极为缓慢的速度。分枝杆菌在适合的体外条件下，其倍增时间约为17h，这是至今所知自由生活的细菌中倍增时间最长者。分枝杆菌在特殊的体内条件下也表现这种生长速度。不能在体外生长的麻风分枝杆菌，据推断其倍增时间可达7天。

多数非致病性土壤分枝杆菌都有较高的生长速度，并可根据人为的区分标准，即在7h是否可见试管中的可见生长而将分枝杆菌分为快速和缓慢生长两类。近年来发现这种分类方法较为实用。所有的缓慢生长细菌发现只有单一的rRNA操纵子，而所有快速生长细菌则有两个。近年根据16SrRNA序列的系统发育分析结果，可将快速和缓慢生长细菌分别置于进化树的两个截然不同的分支之内。

（一）体内和体外生长速度

除了个别例外，一般同一菌种的体内生长速度较之体外者为慢，因为体内测定必须有增殖、抑制和杀灭的结果，因而在体内一般不易评估真正的细胞分裂时间。但是如能显示在不同器官内、不同的宿主基因型之间及不同菌株之间细菌生长速率有显著地差异时，这种测定则是很有意义的。而且这些体内倍增时间往往与一般的易感性、宿主防御力以及其他方面的临床资料相关，North和Izzo在严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠中所进行的一项典型实验结果列于表6－3。

表6－3　未经治疗或以氢化可的松治疗的SCID和CB17小鼠不同器官中分枝杆菌的倍增时间＊

＊：倍增时间是在静脉感染的第1天和第25天后分别测定每一器官中的细菌数目；＊＊：在10，15和20天时皮下注射2.5 mg氢化可的松；NC：未计，因第25天的菌数并未超过第1天的菌数。

由上表中可见，经有毒力分枝杆菌感染并用氢化可的松处理的SCID小鼠中的细菌生长最快。在这些动物的肺和脾脏内的净倍增时间为17～18 h，表明这是一种未受限制的细菌生长。其他器官中的倍增时间稍长（20～22 h），说明这是未受限制生长的稍受干扰。无毒菌株在此情况下生长较慢。其倍增时间为35～99 h。在正常小鼠的肺脏中有毒力的Erdmanjun株的倍增时间为28.3 h；H37Rv的倍增时间为64.4 h。有毒力分枝杆菌在所有动物的脏器内以对数增殖方式生长，但生长速率变化很大，其中最长的倍增时间为H37Rv在正常小鼠肝脏中的197.2 h。无毒力菌株生长极慢，即令在氢化可的松处理的SCID鼠和很多情况下都有很长的倍增时间。SCID小鼠肾脏中的倍增时间在17 d以上，或者就根本不能生长。由这些研究可得到这样的一个结论，即分枝杆菌的体内生长如同其在适宜的体外生长条件一样快速。另一结论为，对分枝杆菌生长的限制和抑制是免疫系统的一项重要功能，而且这项功能在肾脏和肝脏较之脾脏和肺脏中者更为有效。

（二）分枝杆菌生长速度的确定

分枝杆菌极慢生长速度的原因何在？有两种主要的可能性：①所有的分枝杆菌代谢过程速度，包括酶的活性约为大肠埃希菌相应过程速度的1/5；②多数分枝杆菌的代谢过程速度与一般真细菌相同，只是有少数例外。这些例外生长很慢，而且速度受到限制。

后一可能性较为正确。曾经研究过许多分枝杆菌的酶类，其中很多都与大肠埃希菌相应酶类活性大致相仿。

（三）影响分枝杆菌生长速度的因素

在液体培养基中生长的一些分枝杆菌于培养基表面形成菌膜，这种菌膜可因非离子性去垢剂，如Tween 80的作用而破坏，使在培养基中形成均匀生长。近期在分枝杆菌生长的研究表明，在接种量小时，快速无限制性的生长可导致细菌生活能力丧失；而在大接种量时，缓慢生长则可保留细菌的生活能力。玻璃培养器皿与细菌的接触面积较小时，细菌的生长与活力均较好。有人报告热处理的牛血清白蛋白能增强分枝杆菌生长。此外，各种白细胞介素也可增强体外分枝杆菌的生长，以及巨噬细胞内的分枝杆菌生长。另有人报告，鸟分枝杆菌可通过一特异受体摄取IL－6。

六、麻风分枝杆菌

由于麻风分枝杆菌能在犰狳体内大量繁殖，故可用以从犰狳组织中纯化细菌。纯化的细菌即可再用以进行各种代谢研究及在各种类型的培养基中检测其生长。近年发现棕榈酸可作为一种可供细菌体外生长的良好可氧化物质，而且还原性硫氢基化合物加二硫苏糖醇（dithiothreitol）可以增强在DH培养基中的生长。在目前所能提供的最好条件下，16周生长的菌数有4～6倍的增加，而且呈线性生长，而不是对数期生长。线性生长只有在两个姐妹细胞当中只有一个细胞能够进一步增殖时方可发生，提示有些增殖所必需的细胞内因子不能为细菌本身合成。如果由于培养基中缺少某种生长速度限制因子而使生长速度逐步下降时，即可发生线性增殖。被认为可限制麻风分枝杆菌生长的因子有：①铁质摄取，麻风分枝杆菌缺少分枝菌素，只能摄取其他分枝杆菌速率中1.5%的外源性外螯合素（exochelin）－铁复合体，而且此种摄取与能量依赖的输送无关。②类脂合成麻风分枝杆菌不含可测出的乙酰CoA合酶，并且不能合成维持其生长速度所必需的类脂。

七、结论与展望

近年有关分枝杆菌的生长、生理、生化和遗传等方面的研究有了很大的进展。而且这些进展中有些对于创建新的治疗措施是有益的。研究结果表明，分枝杆菌有3项特征有别于其他真细菌，即分枝杆菌细胞壁的结构和化学、存在蛋白质剪接和明显的缓慢生长速度。有关细胞壁的研究长期以来即为关注的焦点，而且研究阐明了分枝杆菌细胞壁进化上的相互关系。细菌缓慢生长的分子基础可能是因为rRNA的低度基因剂量加上慢转录速度，这将在不久的将来加以证实。第3个特点为RecA蛋白质上出现蛋白质剪接。在统计学基础上可以预期蛋白质剪接在分枝杆菌中是较为常见的，从而使分枝杆菌以这种未所期料的方式而有别于其他真细菌。

（余传霖）

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