(一)胆汁的因素
1.胆道胆固醇的高分泌 近年来国内外学者进行了很多研究及探索,胆管胆固醇的过高分泌被认为是最重要的病理生理改变,由此引发胆囊动力低下、胆固醇过饱和结晶形成以及胆囊黏液的高分泌和炎性细胞渗出,最后形成胆囊胆固醇结石。目前,对于胆管胆固醇高分泌发生机制的研究已经成为研究胆囊胆固醇结石形成的关键。从理论上说,胆管胆固醇高分泌可能由以下原因引起:①肝脏胆固醇合成增加;②肝脏从血浆脂蛋白获取胆固醇增多;③肝内胆汁酸合成减少;④肝内胆固醇酯化减少;⑤肝脏胆固醇酯水解增加;⑥肝脏胆固醇胞内转运及微管膜胆固醇转运出胞增加。这些改变均可引起肝脏游离型胆固醇浓度增加,从而增加胆汁中胆固醇浓度,形成胆囊胆固醇结石的可能性。
胆汁酸的合成是肝脏胆固醇代谢的一个重要去路,包括2种途径:中性途径与酸性途径。胆固醇7A-羟化酶(CYP7A1)和胆固醇27-羟化酶(CYP27)分别为两条途径的限速酶。CYP7A1特异性地存在于肝脏,催化经典途径的限速步骤反应。CYP27属细胞色素P450超家族,是胆汁酸合成酸性途径中的限速酶,广泛存在于线粒体。肝细胞合成的胆汁酸由细胞膜的转运蛋白主动转运到胆管腔内,转运胆汁酸的转运蛋白最主要的是属于ATP结合盒(ATP-binding cassette,ABC)超家族成员的Pgp3。
ABC超家族包括大约50个原核或真核细胞膜蛋白,主要功能是转运广泛的作用底物,包括氨基酸、脂质、脂多糖、有机离子、肽类、糖类、金属和蛋白质,通过消耗ATP的方式,ABC转运蛋白可以转运多种底物逆浓度梯度进出细胞。典型的ABC转运蛋白的结构是由2个跨膜单位和2个ATP结合域形成一个多肽链,跨膜单位有6~11个跨膜区和2个ATP结合位点,跨膜区作为膜通道有利于物质转运,其特异性氨基酸序列确定转运蛋白的种类,ATP结合位点位于胞内,与能量供应有关,并能结合多种底物。目前,在人类发现了50多种ABC转运蛋白,可以分成几个不同的家族,分别命名为ABCAABCG家族。许多ABC转运蛋白与人类疾病至关重要,最主要的是P.糖蛋白(P.glycoprotein,PgP)多基因家族,人类PgP家族包括2种成员:Pgpl和Pgp3,分别是ABCBl基因和ABCIM基因的产物。Pgpl与肿瘤对多种化疗药物耐药有关,Pgp3可以将肝细胞内的卵磷脂和胆汁酸泵出到胆管腔。研究发现ABCB4基因突变可以导致3型家族性肝内胆汁淤积病,患者表现为高胆红素血症和1-谷氨酰转肽酶升高。胆汁中的胆汁酸是防治结石形成的重要因素,胆汁酸分泌入胆管后能够溶解胆固醇,减少游离固醇浓度,因此肝细胞微管面胆汁酸的排泄减少,不仅增加胆汁中游离胆固醇浓度,同时也减少了胆汁中胆固醇的溶解,胆汁内胆固醇呈超饱和状态,胆固醇容易形成结晶,理论上促进了胆囊胆固醇结石的形成。因此,胆囊胆固醇结石的发病机制可能与肝细胞的ABCB4基因突变或表达的异常有关。
2.肠道吸收胆固醇增加 体内胆固醇主要来源于自身合成和食物吸收两部分。机体20%~25%胆固醇由肝脏合成。以往研究多数显示胆石症患者肝脏胆固醇合成限速酶活性并不增加,表示胆汁胆固醇含量的增加不是来自于肝脏合成增多。近期研究显示胆石症患者空肠黏膜NPC1L1基因表达显著增加,同时ACAT2基因表达也增加。胆石症患者的小肠胆固醇摄取和酯化增加,表示从肠道吸收胆固醇的来源增多,可能成为胆石症发病的重要机制,同时提示,小肠是研究胆石症机制时需要考虑的重要器官。动物实验证实,药物ezetimibe抑制NPC1L1或者靶向阻断Acat2基因,Apo B48基因等均可以降低小肠胆固醇摄取而预防小鼠胆石的形成。
(二)胆囊在胆石形成机制中的意义
尽管成石胆汁来源于肝脏,肠道也参与成石机制,然而胆囊是胆囊结石病的终末器官,是结石形成的病灶部位,并最终产生一系列结石的病变,其病理意义不言而喻。胆囊运动功能异常直接导致结石形成已有临床和动物研究的多方面依据。
1.胆囊黏膜功能异常
(1)胆囊黏膜吸收功能异常:胆囊上皮在消化间期能吸收大量的水和电解质,浓缩胆汁。胆囊上皮吸收功能的改变可导致结石产生。胆囊上皮组织除了能吸收胆汁内的水分和无机类电解质,使有机成分浓缩外,还能吸收一些脂溶性物质(如某些游离胆汁酸、胆固醇、溶血卵磷脂、X线检查对比药),从而改变肝胆汁的组成,使之转变成胆囊胆汁。正常胆囊黏膜能吸收约50%的Ca2+,降低胆汁游离Ca2+浓度,同时分泌H+以酸化胆汁,增加钙盐的溶解度。当吸收与分泌功能改变时,胆囊的酸化功能发生障碍,腔内p H升高,胆汁中游离Ca2+呈过饱和状态,钙盐沉淀导致结石。目前认为胆囊黏膜吸收功能改变可能是胆囊胆固醇结石形成过程中最初环节,致石胆汁刺激黏膜引起其吸收与分泌功能紊乱,影响收缩功能,增加致石胆汁的细胞毒作用,从而启动胆汁淤积等一系列病理变化。
(2)胆囊黏膜分泌功能异常:大量动物实验证明经高胆固醇饲料喂养后,动物胆囊黏膜表面分泌黏液增多,其内含有促成核蛋白和抗成核蛋白。促成核蛋白包括黏蛋白、清蛋白、Con-A结合非黏性糖蛋白(IgG,Ig M,磷脂酶C,氨基肤酶N、触珠蛋白、抗糜蛋白酶、纤连蛋白),84kd糖蛋白等,抗成核蛋白包括apo A,apo A2,Ig A,15kd糖蛋白等。高分子量黏蛋白是胆囊黏膜上皮产生的主要有机成分,包括多肽核和寡糖侧链,有大量的疏水区,是双极性分子,能连接胆色素、CH、PL等,促进结晶成核,在胆囊结石的形成中起重要作用。
2.胆囊收缩功能异常 胆囊收缩功能障碍是机体胆囊胆固醇结石形成过程中的一个重要环节,也是形成机制的经典学说。研究表明,胆囊收缩功能障碍只存在于胆固醇结石患者,在胆色素结石患者则不存在或不明显。胆囊收缩功能异常,排空延迟,导致含过量胆固醇的胆汁在胆囊内滞留,使胆盐不能及时进入肠道进行肠肝循环,胆汁中胆盐浓度下降,胆汁酸池缩小,影响微胶粒的形成;胆囊收缩功能下降,胆囊的“风箱”运动减弱,使混合微胶粒上富含胆固醇的小泡和小泡聚集物分层,有利于胆固醇的析出、成核;尤为重要的是胆固醇结晶的形成、聚集、析出、成核及结石的生长,需要足够的时间,而胆囊排空功能下降、胆汁在胆囊内淤滞恰好提供了良好的时空条件。最终各种因素共同作用的结果可能会导致或加速胆囊结石的形成。胆石症患者的胆囊收缩功能下降机制不明,妊娠、肥胖、糖尿病、长期服用奥曲肤与阿托品、低热卡饮食、全胃肠外营养(TPN)、迷走神经干切除、高位脊髓损伤都可影响其收缩功能。目前研究较多的因素包括以下方面:
(1)缩胆囊素(cholecystokinin,CCK)及其受体:CCK作为调节胆囊运动的重要胃肠道激素,主要参与餐后胆囊收缩与排空。体内、体外研究显示胆石患者的胆囊CCK受体数目减少、受体表达降低以及信号传导减弱。当前对胆囊运动调节过程的认识概括为:①空腹移行运动复合波的Ⅱ期末分泌胃动素,维持胆囊较弱的收缩;②餐后分泌CCK导致胆囊强烈收缩,使胆汁酸进入十二指肠和小肠,直接溶解、消化吸收胆固醇、脂肪以及脂溶性维生素;③当胆汁酸到达末端回肠时,通过Farnesoid X受体介导产生和分泌FGF 19,作为胆囊再充盈的信号传导,为进餐前作准备。因此,CCK和FGF 19都参与胆囊的运动调节,在胆石形成的动力机制中占有重要地位。
此外,CCK和相应细胞膜上的CCK-A受体正常结合,介导胆囊平滑肌的正常收缩。有研究从蛋白质水平上说明,CCK-A受体数目的减少是引起胆囊收缩功能障碍,最终导致胆囊胆固醇结石形成的重要原因。CCKA受体基因在人类胆囊壁高度表达。CCKA受体的基因表达、结构改变及其多态性致使胆囊收缩障碍进而形成胆囊结石。
(2)Cajal间质细胞:胆囊的运动功能依赖于胆囊节律性收缩和舒张,以浓缩、存储和排出胆汁。生理情况下,空腹和餐间Oddi括约肌压力高于胆总管和胆囊管的压力,从而迫使胆汁流向胆囊;进餐后,胆囊收缩,Oddi括约肌松弛,胆汁排入十二指肠以辅助消化。可见,胆囊的运动功能有重要意义。
自1893年西班牙神经解剖学家应用甲基蓝和镀银染色在豚鼠和家兔小肠中发现Cajal间质细胞(Interstitial cells of Cajal,ICC)以来,学者们对胃肠道ICC的形态、超微结构、起源及生理功能等进行了一系列研究,明确了ICC是一种特殊的间质细胞,它是以网状形式分布于整个消化道的间质细胞。ICC是胃肠慢波的起搏细胞及神经兴奋传导细胞,对胃肠平滑肌节律运动具有重要调控作用。目前研究表明多种胃肠道疾病与ICC有关,包括糖尿病性胃瘫、假性肠梗阻、慢性便秘、贲门失弛缓症、获得性巨结肠等,通过恢复和改善胃肠道ICC的分布对胃肠道疾病有明显治疗作用。近年来,有学者在胃肠道以外的器官或组织也发现存在Cajal间质细胞,如膀胱、胰腺、子宫等,这些胃肠道以外的器官或组织存在一个共同点:它们都具有“自主节律性收缩”的运动模式,有相似的起搏和收缩功能,并且其器官和组织功能都需要通过这种运动模式来完成。
由于在人体组织、器官的广泛存在与重要功能,使得ICC特异性鉴定方法成为其相关研究的基础。光镜下ICC无特征性形态学标志,电镜下ICC及其超微结构与成纤维细胞较接近,ICC的电镜鉴别有时仍较困难。同时,学者们发现可用亚甲蓝染色来标记ICC,并成功地用于鼠胃肠道ICC的标记。近年发展的c-kit免疫组化法成功应用于ICC研究,并大大地促进了对ICC的认识。c-kit是位于质膜上的酪氨酸激酶生长因子受体,是识别ICC的有效标记物。目前学者们仍认为电镜是观察鉴别ICC较明确的方法,甚至将其视为金标准。因此,应用c-kit免疫组化技术再结合电镜研究,使得人们有了鉴定ICC的可靠方法,为鉴定ICC开辟了新纪元。
胆道平滑肌与胃肠平滑肌相似,也存在自发节律性运动。在动物模型和人体的胆道研究均显示,ICC在胆囊、胆囊管、肝内胆管、胆总管、Od di括约肌等多处存在,并参与了胆管自主节律运动的调控。胆道系统疾病如胆源性胰腺炎、胆汁淤积、胆囊结石、胆管结石均与ICC有关。同时,研究证实,ICC存在于人体胆囊组织中,是胆囊的起搏细胞。有研究指出,胆囊ICC中存在胆囊收缩素A型受体(CCK-AR)的表达,提示CCK可能通过ICC和(或)通过胆囊平滑肌上CCKAR而诱发收缩活动,ICC可能是神经系统控制平滑肌运动的中介。之后有学者研究显示,高胆固醇饮食可以使豚鼠胆囊c-kit(ICC特异性表达基因)阳性细胞表达数量减少,出现动力障碍,提示与胆石形成过程有关;进一步研究提示,胆道梗阻可以导致胆囊ICC的损伤,从而在胆囊炎症、动力障碍中发挥作用并证实,中性粒细胞与ICC之间存在突触联系,去除梗阻因素后,胆囊ICC超微结构有所改善,胆囊平滑肌肌张力对兴奋性神经递质的敏感性较梗阻时有所增加。以上研究均提示,胆囊动力异常与胆囊黏膜炎症密切相关,是胆石形成早期的重要事件,ICC是其中的重要环节。
总而言之,胆囊ICC是胆囊的起搏细胞,在胆道动力功能及其动力障碍性疾病中有重要作用。
(三)胆固醇结石病与代谢综合征
1988年Reaven等在Banting报告中首次提出代谢综合征,又称为胰岛素抵抗综合征,即靶器官与组织对胰岛素作用不敏感。胆固醇结石发病率随年龄的增长而增加,且有女性及肥胖者多发的特点,胆石病与肥胖之间的关系反映了胆石症与代谢综合征有相关性。代谢综合征(MS)主要表现为向心性肥胖,糖耐量异常或糖尿病、高血压病、血脂增高、心血管病危险性增加。胰岛素抵抗患者常发展为2型糖尿病,后者的胆石发病率增加2~3倍。代谢综合征致胆石病的机制:
1.脂质代谢异常导致胆汁成分改变——胆汁胆固醇过饱和 胆囊胆固醇结石形成的必要条件是肝脏向胆汁中分泌胆固醇增加,导致胆汁胆固醇过饱和,同时还可以伴有胆汁酸合成减少。MS的血脂紊乱以高三酰甘油、高胆固醇和低HDL-C为特点,与胆石症患者的血脂成分改变类似。研究表明,肥胖的胆石症患者血清总结合胆汁酸较对照组高,而胆囊内胆汁酸含量却明显减少。MS会导致肝脏胆汁酸合成能力降低,胆汁酸池缩小,胆汁酸分泌减少从而形成易于成石的胆固醇过饱和胆汁。关于胰岛素抵抗(IR)、高胰岛素血症诱发胆囊结石的机制尚存争议,其机制可能是由于IR导致的糖脂代谢异常,继而肝脏对胆汁成分代谢发生改变,胆固醇分泌增加和(或)胆汁酸合成减少、胆囊运动异常,使成石的危险性增加。血清中高胰岛素还能促进胆固醇合成限速酶HMGCR的活性而导致胆固醇合成增加,从而使胆汁胆固醇饱和度上升呈过饱和状态,促使胆石形成。高胰岛素可激活低密度脂蛋白受体,使肝细胞对血浆低密度脂蛋白胆固醇摄入增加,并进一步增加肝脏分泌胆固醇入胆汁的量,形成胆固醇过饱和胆汁。最后,高胰岛素血症可刺激小肠对食物中胆固醇的吸收,从而增加肝脏外源性胆固醇的来源。
2.胆囊排空异常 胆囊的排空功能异常是引发胆石症的另一个重要因素。因为MS患者血液的长期高糖状态,红细胞滞留度增高,血流阻力增加或微小血管阻塞导致微血管病变,神经滋养血管出现微循环障碍,导致神经传导速度减慢、自主神经功能障碍和胆囊收缩不良,这与糖尿病患者因自主神经功能障碍引起胆囊收缩功能障碍具有相似的机制。糖尿病患者空腹及脂肪餐后胆囊的体积都较正常人群增大,收缩功能明显减弱,胆囊排空分数显著减少。其次,糖尿病伴胆囊结石患者体内缩胆囊素(CCK)受体减少,也可导致胆囊排空障碍。
3.胆汁细菌感染 MS患者易并发感染,有利于细菌的繁殖,使成石的危险性增加。有调查表明糖尿病患者的胆汁细菌培养阳性率高达50%~90%。Swidsinski等PCR法检测发现,在常规细菌培养阴性的胆固醇结石中细菌DNA检出率高达80%。细菌产生的磷脂酶,可将卵磷脂降解为软脂酸而沉积,具有促成核作用;同时能促进胆囊上皮分泌黏蛋白,该物质是胆石形成的基质,可促进结石的形成。
(四)细菌与胆固醇结石
健康人的胆囊内一般是没有细菌生长的,因为Oddi括约肌与胆汁流有效地抑制了细菌的侵袭与繁殖。而当机体免疫力降低或正常的防御功能受损时,一些机体正常菌群转变为条件致病菌,通过胆管逆行感染或通过血液及淋巴循环进入胆囊,引发急、慢性胆囊炎并成为胆囊结石形成的始动因子。Swidsinski等应用聚合酶链反应技术和16S r RNA序列分析法,在20例胆汁细菌培养结果为阴性的胆固醇结石中发现大量细菌DNA,阳性率为80%,其中痤疮丙酸杆菌的阳性率为45%,其余菌种包括大肠埃希菌、化脓性链球菌、铜绿假单胞菌和艰难梭状芽胞杆菌等,在胆固醇含量超过90%的结石中则未检出细菌DNA,由此推断细菌可能与胆固醇结石的形成有一定关系。杨玉龙等对胆固醇结石进行电镜观察,在结石的核心和外周中均发现有细菌存在,认为细菌为胆囊结石核心形成的重要因素之一。然而,胆汁细菌感染是发生在胆石形成前还是形成后仍不明确,但可以肯定胆固醇结石不是无菌的。
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