(一)材料与仪器
1.受试样品 猫爪草总提取物、猫爪草石油醚萃取物(A)、氯仿萃取物(B)、乙酸乙酯萃取物(C)、正丁醇萃取物(D)及水提物(E)5个部位(自制)。氟尿嘧啶(上海制药十二厂提供,批号20020125)。
2.细胞株 人肺癌细胞株A-549、人白血病细胞株HL-60、人宫颈癌细胞株Hela,购自山东大学医学院动物实验中心。
3.试剂 RPMI-1640培养基干粉(美国GIBCO公司产品)、胰蛋白酶(美国Serva公司出品)、FCS(小牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司产品),MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑](Sigma公司产品),BCG与LPS(北京生物制品研究所),D-Hanks液、DMSO(二甲亚砜)等。氯化钠注射液(哈药集团制药六厂,批号:040516)、吐温-80(天津市化学试剂工厂,批号:031112)。
4.仪器 CO2恒温培养箱(日本三洋公司)、超净工作台(北京半导体设备厂)、倒置显微镜、酶联免疫仪(Thermo Labsystems)、低速离心机(北京医用离心机厂)、FA2004型电子天平(上海天平仪器厂)、电热高温消毒箱(上海医疗仪器厂干燥箱)、海尔冰箱(-20℃,4℃)、培养瓶、96孔平底细胞培养板(USA Deta)、离心管、培养皿,尖嘴吸管,石英蒸馏器、液氮罐,恒温水浴箱等。
(二)方法与结果
6个样品组各设4个不等浓度,A,B,C用含有DMSO的氯化钠注射液充分溶解,总提取物及D用含有吐温-80的氯化钠注射液配制,E用氯化钠注射液配制,以相应空白溶液为对照,用MTT和SRB两种方法进行体外对3种肿瘤细胞增殖的影响。
1.MTT法 采用RPMI-1640培养液,含青霉素10万U/L,链霉素10万U/L,10%新生小牛血清(FCS,56℃灭活30min),缓冲液调pH至约7.2,将待测细胞株配成单个细胞悬液。取对数生长期细胞以0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化后,用培养液稀释至浓度(4~5)× 104/ml,接种于96孔板,每孔加入190μl。同时设溶剂对照,每个剂量设3个平行孔,常规培养24h后,加入不同剂量的受试样品,在37℃饱和湿度、5%CO2培养箱中培养72h,后,每孔加入MTT溶液(用生理盐水配制)10μl(5mg/ml),振荡混匀后,继续培养4h。吸去上清液,每孔加入150μl二甲亚砜,轻轻振荡,约1h后,用酶标仪在570nm波长处测其OD值,计算抑制率,求IC50,测定时减去空白对照。按下列公式计算抑瘤:抑瘤=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%
2.SRB法 细胞接种和药物处理同MTT法,空白对照液只加完全培养液,不加细胞。样品处理48h后,每孔加入50μl冰冻的50%三氯醋酸。4℃固定1h后,用自来水洗去三氯醋酸、培养基、小分子量代谢产物以及血清蛋白。将培养板纸在空气中干燥,用0.4%SRB(W/V,1%醋酸溶解)对三氯醋酸固定的细胞染色30min,随后用1%醋酸洗去游离染料,置于空气中干燥样品;每孔加入150μl 10mmol/L Tris,轻轻振荡,直至染料全部溶解。于564nm波长处测OD值,测定时应减掉空白OD值。细胞生长抑制率计算方法同1.。
3.结果 猫爪草总提取物及石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇及水5个部位对人白血病细胞株HL-60,人肺癌细胞株A-549及人宫颈癌细胞株Hela作用有明显差异,结果见表4-8~表4-10。
表4-8 猫爪草不同提取物(RRT)热用MTT法对人白血病细胞株HL-60的作用(n=3)
(1)P<0.05;(2)P<0.01 与阴性对照组比较
表4-9 猫爪草不同提取物用SRB法对人肺癌细胞株A-549的作用(n=3)
(1)P<0.05;(2)P<0.01 与阴性对照组比较
表4-10 猫爪草不同提取物用SRB法对人宫颈癌细胞株Hela的作用(n=3)
(1)P<0.05;(2)P<0.01 与阴性对照组比较
从表4-8~表4-10中可以看出,猫爪草总提取物及石油醚、氯仿部位在受试的4个剂量(1μg/ml,10μg/ml,100μg/ml,500μg/ml)下对人肺癌细胞株A-549,人白血病细胞株HL-60及人宫颈癌细胞株Hela 3种瘤株的抑制率均<50%;乙酸乙酯部位在500μg/ml受试最大剂量下对上述3种瘤株的抑制率分别为55.02%,76.49%,66.87%;正丁醇部位在100μg/ml剂量下对上述3种瘤株的抑制率分别为58.56%,36.88%,55.96%,在500μg/ml抑制率分别为75.97%,65.62%,94.88%;水提部位4个剂量对HL-60瘤株的抑制率均<50%,在100μg/ml剂量下对A-549及Hela细胞的抑制率均>50%,但剂量500μg/ml抑制率不及100μg/ml剂量。说明猫爪草总提取物及石油醚、氯仿部位无明显的抑制作用;乙酸乙酯、正丁醇部位具有明显的抑制作用,与阴性对照组比较有显著性差异,且抑瘤率与给药剂量呈明显的正相关关系;水提部位对A-549及Hela细胞具有一定的抑制作用,但与剂量无相关关系,100μg/ml抑瘤作用最强,过高过低都影响实验结果。从直观分析可看出正丁醇部位抑瘤效果最强。
随着分子肿瘤学研究的不断深入,体外抗肿瘤实验已成为抗肿瘤药物研发过程中必不可少的一部位。该方法具有经济、快速、高效的优点。目前最常用的体外抗肿瘤筛选方法有MTT法、SRB法及XTT法。实验,采用系统溶剂法获得提取中对猫爪草总提取物及石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇及水5个萃取部位,采用MTT和SRB两种方法,选用3种与临床应用有较好一致性的肿瘤细胞株S-180,艾氏腹水瘤EAC及人乳腺癌细胞株MCF-7进行抑瘤试验,以期得到具有较高可信度的体外抗肿瘤活性的有效部位,同时为猫爪草的进一步研究提供依据。
猫爪草体外实验结果表明,经过系统提取分离后,猫爪草正丁醇和乙酸乙酯部位具有明显的抑瘤作用,水提部位也有一定的抗肿瘤作用。本实验为猫爪草抗肿瘤有效成分的筛选及抗肿瘤作用机制,提供了一定的理论依据,但其是否具有其他方面的抑癌作用以及作用机制仍有待体内实验进一步研究。
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