微纳观力学是指在微米级至纳米级分辨率对材料结构和力学特性进行研究分析,是现代材料力学的新兴研究方向。骨微纳观生物力学的研究范围涵括了从微米级的骨小梁空间结构,至纳米级的羟磷灰石有机复合物等骨细微结构的研究。根据研究技术的侧重点不同,骨微纳观生物力学可分为两类:一类以纳米压痕技术(nano-indentor)、原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)等为代表,着重研究骨材料结构及其力学表征;另一类,以高分辨率 CT 为代表,重点分析骨内部空间微结构特征,结合有限元分析(finite element analysis)研究骨组织力学性能。
1. 纳米压痕技术 20世纪60年代,Weaver和Amprino等首次利用微米级大小的装置直接压痕(indent)骨微结构,测量微观骨硬度(microhardness)获得成功。随后,Weaver 对人骨进行了一系列实验,得出如下结论:①干骨微硬度高于湿骨;离体骨经自然酶解后,微硬度下降。②微硬度能准确、可靠地反映骨矿化程度。③同一个体不同部位骨皮质微硬度变异大,不同个体同一部位骨皮质微硬度接近。④骨皮质发育成熟后。除 Paget 骨病、肾性佝偻病、成骨不全等某些特殊疾病能造成微硬度下降外,微硬度基本保持不变,不受骨质疏松程度影响。Wang等对liliput dtc232基因突变的斑马鱼骨进行纳米压痕实验,发现突变后的斑马鱼椎体骨组织的纳米硬度和弹性模量较野生型显著下降。Hengsberger等发现雌激素缺乏结合低蛋白饮食会显著降低大鼠椎体骨皮质的纳米力学性能,后者经补充必需氨基酸可得到改善。然而,进一步的研究表明单纯去除卵巢并不会引起大鼠骨小梁的材料特性发生显著变化,且骨组织材料的弹性特性并不直接影响骨整体宏观力学的强度(宏观加载,载荷位移曲线的直线段斜率),组织水平的材料特性只与宏观后弹性阶段(postelastic)的力学行为相关。在另一项对 SAMP6 老年性骨质疏松小鼠的研究中,也显示骨质疏松小鼠长骨材料特性与其宏观强度无直接关联,尽管SAMP6小鼠骨皮质较对照组的骨强度和韧性显著下降,但其纳米硬度和弹性模量却反而增高。
2. 原子力显微镜技术 Binning等 1981年利用量子力学隧道效应研制出扫描隧道显微(scanning tunnel microscope, STM),随后在STM基础上改进出AFM,两者均具有纳米级超高分辨率。相对于STM和普通电镜,AFM 样品制备简单,无须染色、包埋、电镀及电子束照射等处理;能在液态、真空、大气等多种环境下进行样品成像,更适合对非导体生物材料的观察,使得AFM较STM在生命科学研究中的作用更为突出。
以纳米尺度衡量,骨是由羟磷灰石晶体和有机基质组成的纳米复合体,分析该复合体纳米级结构有助于阐明骨组织有机、无机成分的结构、功能关系。Hassenkam等运用AFM观察正常小梁骨及其骨折断端表面发现,骨小梁外表面胶原纤维成浓密的编织状结构,每67 nm盘曲成结,压缩成矿化盘,矿化盘之间又相互重叠。另外,在胶原及胶原之间延伸的微丝上缠绕着直径20~30 nm大小结节,这些结节可能为蛋白多糖,较正常小梁骨,骨折断端纤维组织紊乱,可见裸露纤维的短切面。目前尚不知骨小梁表面这些结构特征与其功能有何关系,绝经后骨质疏松骨小梁表面特征变化有待进一步研究。
骨骼在外力作用下产生形变,在弹性形变区内,骨骼通过应变吸收能量,一旦外力移除,骨骼迅速释放能量,恢复原有形状。由于硬的羟磷灰石晶体无法吸收、耗散太多能量,有机基质(主要含胶原)被认为是缓冲外力,吸收、耗散外界施加能量的主要物质基础。Thompson等用AFM对骨胶原进行拉伸实验,结果发现胶原内部和相邻胶原之间,存在所谓“牺牲联结”(sacrificial bonds),外力牵拉使牺牲联结断裂,释放出联结内部的“隐藏长度”(hidden length),胶原纤维长度延伸,每断裂一个牺牲联结所需能量是破坏一个共价键能量的数百倍,甚至上千倍。在首次外力移除,至再次拉伸之前,牺牲联结能重新组合,期间间隔时间越长,重组牺牲联结越多,胶原耗散的能量越多。反复拉伸,胶原又表现为耗散能量下降。胶原所处的离子环境和离子浓度对胶原耗散能量有不同影响,Ca2+环境下,胶原耗散的能量高于Na+环境,离子浓度越高,耗散的能量越高。牺牲联结的本质尚不知晓,可能与多价离子键的形成有关。大鼠骨表面纳米硬度实验显示,牺牲联结重组所需时间,与骨表面压陷后硬度恢复时间相关,提示牺牲联结部分承担了维持骨硬度的作用,对预防骨折发生有重要意义。
有学者应用AFM对骨松质和致密骨进行纳米压痕试验(nano-indentation),不仅有效地捕捉到骨结构单元(bone structure unit,BSU)的表面特征,而且能精确定位压陷区域,测定每个BSU内在力学特性,这些都是传统光学显微镜无法比拟的。该学者进而提出骨组织的微观力学特性可以看作是由具有非常均一材料特性的独立骨结构单元组成的集合。此外,在细胞水平上,用AFM可对成骨细胞进行精确的力学压陷实验,结合激光共聚焦显微镜等其他技术,观察细胞受力后力学信号转导过程。AFM 运用于骨生物力学的研究时间很短,目前研究主要集中于生理状态下骨微纳观研究,随着研究技术的成熟和研究的深入,必会在各种与骨病相关的微纳观力学领域发挥重要作用。
3. 显微CT(micro-computed tomography, micro CT, μCT) 显微CT是指空间分辨率 100μm以下的CT,最初用于工业材料微结构缺陷和应力缺陷检测。其基本工作原理是以微焦点 X 线球管为放射源,二维高分辨率图像增强器为平面探测器,对样本进行整体锥形束扫描和三维重建,与传统医用螺旋CT不同,其球管与探测器固定不动,样品以不同角度旋转。μCT所得的图像分辨率高,能将骨松质与骨皮质区分开来,测得真正意义上的体积骨密度和反映骨组织矿化程度的组织骨密度,并能精确测定骨的三维微结构形态参数,测量参数与传统形态计量参数高度相关,是一种能全面、立体、无创测量骨微结构,评价骨质量及预测骨强度的新兴技术。
由于μCT卓越的空间分辨性能,使无创、实时观察骨微结构微应变变化成为可能,μCT结合有限元分析技术应运而生。有限元分析法是常用的分析不规则变形体的力学方法,其核心思想是将连续弹性体分割为若干个单元(element),各单元以节点(node)相连,进行力学分析,然后将分析结果组合模拟成该弹性体力学模型,计算出整体力学特性。以往,骨组织有限元模型(finite element model,FEM)建立需采用磨片法、微观切片法等对样品加工,获取模型数据。操作过程繁杂,对模型本身有不可避免的数据损耗,且难以完成几何形状复杂、数据量大的分析。在结合了μCT之后,样品可直接经CT实时、动态扫描,图像分辨率高,可直接进行三维重建,极大提高了有限元分析法的精度、速度。
研究表明,由于骨密度与骨强度的相关性并非建立在力学原则之上,单用骨密度为指标无法体现出骨细微的几何特征和密度结构不均一性对骨强度的影响。Crawford等比较了CT测量的骨密度与有限元模型模拟计算的力学指标,结果发现,后者与实际测得的骨强度有更好的相关性。Michael等以CT扫描建立人胸、腰椎有限元模型,经力学试验数据校正后,所得模型能准确预测整个椎体的生物力学特性。
在人的一生中骨始终在经历反复加载和解负过程,即使每次负荷产生的形变都处在弹性形变区内,骨组织仍将出现疲劳所致的微小损伤。在生理状态下,骨组织通过骨重建修复微损伤,维持骨强度。但是,如果微损伤累积超过骨重建修复能力,损伤将逐步扩大、延伸、形成主导裂纹,最终导致骨折。绝经后骨质疏松骨折的发生,就与骨小梁微损伤和骨重建失衡有关。微损伤产生的力学基础,普遍认为与局部应力参数有关,但确切机制一直不明确。Nagaraja等对牛骨松质行单轴压缩,再运用结合μCT的有限元法动态分析,证实骨小梁损伤部位局部应力、应变显著高于非损伤部位,而且微损伤初始化(microdamage initiation)先于表观屈服(apparent yield)。这一结果形象地反映了骨疲劳状态下,微损伤局部的力学变化。Rapillard等利用μCT扫描疲劳压缩前后的人椎体骨发现,μCT测得的骨体积分数及骨小梁结构的各向异性程度能很好地预测骨组织的压缩疲劳强度。目前,有关微损伤如何聚集形成主导裂纹,促使骨折发生的生物力学研究有待进一步深入。
纳米压痕技术获得的测量参数尚未与骨组织材料微观结构及骨宏观力学强度完整有机地统一起来,如何运用该技术结合其他微组织结构分析技术,建立系统的骨组织材料评价体系值得进一步研究。AFM不仅可完成骨矿盐成分和骨基质相互作用的力学评价,尚可直接进行精确的微观压陷实验。尽管目前尚无将 AFM用于骨微损伤研究的报道,但其卓越的分辨性能,应该可以满足表面微破裂(microcrack)的研究。结合μCT的有限元分析,能够胜任骨微结构及微损伤分析,完成动态、无创性骨空间结构力学特性的评估。
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