海洋毒素的测定

河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)是一种海洋生物毒素，分布广泛，不仅存在于河豚鱼中，也存在于其他一些海洋动物体内。TTX是小分子非蛋白质的神经毒素，其毒性是氰化钠的1250多倍，0.5mg即可致人于死命，中毒症状潜伏期短，一般为30分钟至3小时，病程发展迅速，症状较严重。微溶于水，在低p H时较稳定，碱性条件下河豚毒素易降解。河豚毒素对热稳定，于100℃下处理24h或120℃下处理20～60min方可使毒素完全受到破坏。河豚的内脏中毒素含量较高，尤其是卵巢和肝脏含量最高。

TTX的测定方法主要有小鼠生物法、组织培养生物实验法、毛细管等速电泳电压检测法、荧光法、HPLC-荧光检测法、HPLC-MS法和免疫化学测定法等。小鼠生物法发展时间长，方法比较成熟，目前仍广泛采用，但费时费力，对动物要求高，缺乏特异性; 仪器分析能准确定性和定量，确保权威性，但分析时间长，检测费用高; ELISA法特异性强，灵敏度高，对仪器设备要求不高。下面主要介绍ELISA法。

1. 实验原理

样品中的河豚毒素经提取、脱脂后与定量的特异性酶标抗体反应，多余的游离酶标抗体则与酶标板内的包被抗原结合，加入底物后显色，与标准曲线比较进行TTX含量的测定。

2.主要试剂

TTX标准品、抗TTX单克隆抗体、牛血清白蛋白、人工抗原(牛血清白蛋白-甲醛-河豚毒素连接物)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗TTX单克隆抗体等。

3.主要仪器

酶标仪、恒温培养箱、温控磁力搅拌器、分析天平、高速离心机等。

4.分析步骤

1)样品采集和取样

现场采集样品后立即4℃冷藏，并于当天运至实验室进行检验。如路途遥远，可于当天冷冻，并应保存在冷冻状态中运输至检验实验室。对冷藏样品或冷冻后解冻的样品，用蒸馏水清洗鱼体表面的污物，滤纸吸干鱼体表面的水分后用剪刀将鱼体分解成肌肉、肝脏、肠道、皮肤、卵巢(雄性为精囊)等部分，各部分组织分别用蒸馏水洗去血污，滤纸吸干表面的水分后称重。

2)样品前处理

将待测河豚组织用剪刀剪碎，加入5倍体积0.1%的乙酸溶液，用组织匀浆机磨成糊状;取相当于5g河豚组织的匀浆糊于烧杯中，置温控磁力搅拌器上边加热边搅拌，达100℃时持续10min后取下，冷却至室温后，8000r/min，快速过滤于125m L分液漏斗中; 滤纸残渣用20m L0.1%乙酸分次洗净，洗液合并于原烧杯中，置温控磁力搅拌器上边加热边搅拌，达100℃时持续3min后取下，8000r/min离心15min过滤，滤液合并于上一步125m L分液漏斗中; 然后再向分液漏斗的清液中加入等体积乙醚振摇脱脂，静置分层后，放出水层至另一分液漏斗中并以等体积乙醚再重复脱脂一次，将水层放入100m L锥形瓶中，减压浓缩去除其中残存的乙醚后，将提取液移入50m L容量瓶中; 用1mol/LNa OH溶液将提取液调p H至6.5～7.0，并用PBS(磷酸盐缓冲液)定容至50m L，立即用于检测(每毫升提取液相当于0.1g河豚组织样品)。

3)测定步骤

首先用BSA-HCHO-TTX人工抗原包被酶标板，每孔120μL，4℃静置12h; 接着进行抗体抗原反应: 将辣根过氧化物酶标记的纯化TTX单克隆抗体稀释后一部分与等体积不同浓度的河豚毒素标准溶液在2m L试管内混合后，4℃静置112h或37℃温育2h备用，此液用于制作TTX标准抑制曲线; 另一部分与等体积样品提取液在2m L试管内混合后，4℃静置12 h或37℃温育2h备用。此液用于测定样品中TTX含量; 然后将已包被的酶标板用PBS-T (含0.05%吐温-20的p H7.4的磷酸盐缓冲液)洗3次(每次浸泡3min)后，加封闭液封闭， 200μL/孔，置37℃温育2h; 最后将封闭后的酶标板用PBS-T洗3次(每次浸泡3min)后，加抗原抗体反应液(在酶标板的适当孔位加抗体稀释液作为阴性对照)，100μL/孔，37℃温育2h，酶标板洗5次(每次浸泡3min)后，加新配制额底物溶液，100μL/孔，37℃温育10min后，每孔加入50μL2mol/L的H2SO4终止显色反应，于波长450nm处测定吸光度值。

4)结果计算

式中: X——样品中TTX的含量，μg/kg;

m1——酶标板上测得的TTX的质量，ng，根据标准曲线求得;

V1——样品提取液的体积，m L;

D——样品提取液的稀释倍数;

V——酶标板上每孔加入的样液体积，m L;

m——样品质量，g。

5)说明与讨论

①本方法参照国家标准分析方法(GB/T5009.206-2007，鲜河豚鱼中河豚毒素的测定)，采用酶联免疫吸附试验法检测。适用于鲜河豚鱼中TTX的测定，检出限为0.1μg/L，相当于样品中1μg/kg的TTX，标准曲线线性范围为5～500μg/L。

②实验当天不能检测的提取液经减压浓缩去除其中残存的乙醚后不用Na OH调p H，密封后于-20℃以下冷冻保存，在检测前调节p H并定容至50m L立即检测。