对耳蜗功能的保护作用

（一）NO/cGMP通路活化过程

前面已对NO/cGMP通路分别对血管纹、支持细胞以及传入、传出神经递质调节进行了描写，本节总结归纳NO/cGMP通路的关键酶在耳蜗内表达及活化过程。此通路的关键酶均定位于耳蜗。分布于耳蜗的一氧化氮合酶（NO synthases，NOS）的亚型是神经元性一氧化氮合酶（neuronal NOS，nNOS）和血管内皮性一氧化氮合酶（eNOS）。其中nNOS定位于内外毛细胞、螺旋神经节细胞及支配内外毛细胞的神经纤维；eNOS则主要定位于螺旋韧带血管的内皮细胞、血管纹血管的内皮细胞上。sGC和cGK－1在螺旋韧带血管和血管纹血管的外皮细胞、Corti器的支持细胞（Hensen细胞、Deiters细胞）螺旋神经节细胞及传出传入神经纤维上表达。

在NO/cGMP系统中有3个关键酶：一氧化氮合酶（NOS）、可溶性环磷酸鸟苷合酶（sGC）和环磷酸鸟苷依赖性蛋白激酶－1 （cGK－1）。NO/cGMP通路的活化过程是：当外界信息分子与其特异受体结合，引起Ca2＋内流时，由Ca2＋/CaM激活NOS，NOS在黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），黄素腺嘌呤单核苷酸（FMN）四氢生物蝶呤（BH4）及还原型尼克酰胺嘌呤二核苷酸（NADPH）等转氢、转电子体的协同作用下，以L－精氨酸为底物合成NO，NO作为一种气体分子可自由通过细胞膜，其作用范围只与其衰变时间有关。NO通过自由扩散方式透过细胞膜后，与周围细胞胞质内的sGC结合并激活之，活化后的sGC以三磷酸鸟苷（GTP）为底物合成cGMP，后者与cGK－1结合。被激活的cGK－1通过磷酸化过程调节细胞功能（图13－1）。

图13－1　NO/cGMP通路作用过程

NOS有3个亚型，即神经元性一氧化氮合酶（nNOS）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和血管内皮性一氧化氮合酶（eNOS）。此3个亚型的NOS由于分布的不同，而对机体功能产生不同的调节作用。其中，nNOS主要分布于神经系统，由其产生的NO参与神经递质的释放和神经信号的传递；iNOS则主要分布于肥大细胞等免疫细胞中，所产生的NO是作为强氧化剂来杀灭微生物；而eNOS主要在循环系统中发挥作用，它与扩张血管的激素受体共同表达于血管内皮细胞。当扩张血管的激素与其受体结合时，引起的Ca2＋内流可激活eNOS，由此产生的NO可以扩张血管，增加血流量，当由sGC合成的cGMP发挥生理功能后，可被cGMP特异的磷酸二酯酶催化水解，此磷酸二酯酶是Ca2＋/CaM依赖性的。当Ca2＋浓度增加时，既可促进sGC合成cGMP，又可加强磷酸二酯酶降解cGMP。由此可见，Ca2＋在NO/cGMP通路的信息传递过程中发挥着关键作用，它一方面激活NOS产生NO，进而增加cGMP的含量；另一方面又同时激活Ca2＋/CaM依赖性的磷酸二酯酶，而下调NO引发的胞内cGMP增高。

（二）精氨酸对Ca2＋－ATP酶抑制剂的拮抗作用

我们曾采用全耳蜗灌流术，灌流Ca2＋－ATP酶抑制剂，使CAP阈移26dB，然后在灌流Ca2＋－ATP酶抑制剂的同时加入L－精氨酸，发现CAP阈移减小了10dB，可见精氨酸通过NO/cGMP通路可部分拮抗Ca2＋－ATP酶抑制剂的作用。

Ca2＋－ATP酶是细胞排出Ca2＋的重要方式，是维持胞内Ca2＋平衡的Ca2＋泵，且广泛分布于血管纹血管壁的细胞上，通过抑制Ca2＋－ATP酶的功能将导致胞内Ca2＋快速升高，从而造成内、外毛细胞能量供应减少，使内、外毛细胞因能量缺乏而不能维持正常的细胞内外离子平衡，必将引起CM幅度下降、CAP阈值提高。另外，因EP的正常值反映内淋巴高K＋的状态，当血液供应减少时，维持正常EP值的血管纹Na＋－K＋－ATP酶由于能量供应缺乏，使其排K＋功能下降，进而引起EP下降。由于EP的变化引起CM、CAP内环境的变化，故必引起CM幅度下降、CAP阈值提高。

当加入NO的底物——L－精氨酸以激活NO/cGMP通路，由位于血管纹血管内皮细胞内的eNOS催化合成NO，后者通过自由扩散方式进入外周细胞，并与其内的sGC结合生成cGMP，后者则激活cGK－1。活化后的cGK－1通过磷酸化过程抑制Ca2＋进入细胞，并促进Ca2＋库吸收Ca2＋及向细胞外排出Ca2＋，使胞内升高的Ca2＋浓度降低。Watanabe等发现血管纹血管外周细胞内有粗细不同的平滑肌肌纤维样纤维。当血管外周细胞内Ca2＋浓度增加时，足够数量的Ca2＋与细肌丝上的肌钙蛋白结合，在ATP的参与下，粗、细肌丝间发生相对位移，引起收缩反应，造成血管管径缩小。此收缩反应的前提是Ca2＋浓度高于10－5　mol/L。因cGMP激活的蛋白激酶cGK－1通过磷酸化过程抑制细胞内磷脂酶C，降低磷酸肌醇IP3的含量。这一变化可使细胞内Ca2＋浓度下降，肌凝蛋白轻链激酶的活性使降低抑制了肌凝蛋白轻链磷酸化，故改善了由于Ca2＋超载造成的血管痉挛。

结果提示，L－精氨酸（NO的底物）通过激活NO/cGMP通路改善病理条件下（胞内Ca2＋升高）的耳蜗血液循环，为临床治疗相关的耳蜗疾病提供一个新途径。

总之，第二信使广泛存在于机体，在耳蜗中的第二信使对耳蜗功能的调节起到重要作用，在研究IHC与OHC之间，毛细胞与支持细胞之间的细胞间通讯，探讨第二信使的变化更为有意义。关键是要做一个包括IHC、OHC和支持细胞在内的活体标本，通过共聚焦激光显微镜可观察第二信使的运行传递规律，其次，对于NO/cGMP通路中的NO其双重性必须充分认识，小量的NO起到第二信使的作用，而过量的NO则是氧自由基并产生毒性，在细胞间NO如何平衡调节，是需进一步深入探讨的问题。

（李兴启　贾学斌　侯志强）

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