免疫共沉淀蛋白的鉴定

如果实验的目的是证明新的相互作用蛋白，那么下一步就是鉴定免疫共沉淀下来的蛋白。蛋白可以通过直接的Edman测序，或者通过质谱方法来确认身份。以前，Edman测序得到的部分序列信息用来设计cDNA文库中筛选的核苷酸探针。目前，质谱已经成为获得序列信息的主要方法，通过与已知的蛋白或从ESTs、基因组序列中预测的蛋白组成的数据库进行比对可以迅速确认蛋白。

通常，标准规模的免疫沉淀可以获得足够多鉴定蛋白的信息。至少可以得到从Edman测序或质谱中获得的序列信息。通常地，Edman测序方法需要大约10pmol蛋白才能获得其序列（例如50ku蛋白需要500ng）。“State-of-the-art”质谱方法更敏感，可以对微量的蛋白进行测序。1pmol的50ku蛋白大约相当于50ng。这样，虽然通常不能用考马斯亮蓝染色的样品做质谱鉴定，但可以用银染、咪唑，或SYPRO Ruby的样品。然而，需要注意的是经常用在银染中使用的戊二醛不能在质谱方法中使用，在改进的方法中已经去掉了戊二醛。

由于以下原因，质谱成为鉴定蛋白的首选方法：①像前面所提到的，质谱方法比化学测序方法敏感；②由于最近从基因组序列得到的大量信息使质谱方法相对更加便利；③目前质谱方法已经可以直接从蛋白混合物中鉴定出个体蛋白；④质谱方法可以提供蛋白翻译后修饰的信息；⑤质谱方法比化学测序方法更快。由于这些原因，质谱鉴定成为蛋白鉴定的新方法。

质谱方法的特殊优点如上所述，它能使纯化的多蛋白复合物的各个组分被分别鉴定。有报道用LC-MS／MS鉴定了大量与凋亡抑制蛋白共沉淀的蛋白。也可用ESI-MS／MS鉴定通过凝胶过滤和亲和色谱纯化的酵母和人RNA剪接体。ESI-MS／MS也可以鉴定经免疫纯化的酵母细胞周期末期促进复合物（APC）的亚基，它是一个促使细胞退出有丝分裂过程的蛋白泛素连接酶复合物。最近，还有两个研究小组用LC-MS／MS鉴定了体内与BRCA1相关的蛋白。在这个方法中，BRCA1直接从细胞提取物中免疫共沉淀，并且用LC-MS／MS鉴定免疫共沉淀蛋白。BRCA1存在于高分子量复合物中含有肿瘤抑制因子和DNA损伤修复蛋白。在另一个方法中，一个含有BRCA1的复合物通过离子交换色谱和免疫亲和色谱纯化，然后用LC-MC／MC鉴定了SWI／SNF染色质重塑家族成员BRCA1的相关蛋白。