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制备注意事项

时间:2022-02-16 百科知识 版权反馈
【摘要】:(一)培养环节应注意用于培养的标本细胞状态是否良好,是否存在细胞不新鲜、破碎、溶血、凝集、污染等情况,是否有足够的细胞活性。标本采集后应尽快接种,避免过高或过低的环境温度影响细胞活力。因此需要注意以下方面:低渗液浓度适当、作用时间把握好、尽量用气泡吹打细胞以保证细胞充分混匀、在合适的温度下进行低渗等。反复多次固定细胞,洗去杂质和细胞碎片,并保证固定充分。
制备注意事项_恶性血液病细胞遗

(一)培养环节

应注意用于培养的标本细胞状态是否良好,是否存在细胞不新鲜、破碎、溶血、凝集、污染等情况,是否有足够的细胞活性。标本状态的好坏决定了所收获的中期分裂象的数量。解决办法:保证足够的骨髓标本采集量,2~4 ml,注射器内应预吸适量肝素钠生理盐水,采集后应立即混匀骨髓,动作轻柔,避免骨髓液溶血或凝集。标本采集后应尽快接种,避免过高或过低的环境温度影响细胞活力。在细胞培养过程中,须严格遵守无菌操作原则,同时在培养体系中需加入一定量的青霉素/链霉素以预防细菌感染。

培养基及试剂方面的常见问题:培养基过期、pH变化、不同批次培养基稳定性差异太大,造成收获的分裂象少甚至无分裂象。解决办法:应选择质量稳定可靠的培养基及配套试剂。培养体系中必须包括1640培养基、胎牛血清、缓冲系统、谷氨酰胺、双抗等,配制过程需严格无菌操作,在更换不同批次培养基时必须设置与旧培养基的平行对照。

PHA是外周血标本染色体制备最常用的有丝分裂原刺激因子。对于细胞刺激因子的应用原则需选择质量稳定的试剂,通过充分的预实验确定合适剂量以达到理想的效果。但对于除CLL、MM以外的血液系统恶性肿瘤,培养体系中不应加入刺激因子以免干扰核型分析结果。

需要提供适合细胞生长的良好外部环境:培养箱无菌、温度及湿度稳定、适宜的CO2浓度等。

(二)收获环节

细胞收获是染色体制备的关键环节,对操作人员个人经验的要求非常高。实验中是否使用同步化试剂、收获时间的把握、低渗溶液以及固定液的配制、低渗时间的控制、固定的次数和时间、操作时的动作强度等均会影响染色体的收获效果,很难做到统一稳定,在此我们也列出几个重要影响步骤:

对细胞有丝分裂抑制剂的应用需选用稳定可靠的试剂,各个实验室应根据自己的实验情况确定秋水仙碱的剂量和作用时间。

低渗需适当充分。由于肿瘤细胞抗机械损伤能力差,适当充分是在保证充分低渗的前提下不让细胞破碎,以免引起染色体随机丢失,干扰后期的染色体分析。因此需要注意以下方面:低渗液浓度适当、作用时间把握好、尽量用气泡吹打细胞以保证细胞充分混匀、在合适的温度下进行低渗等。

反复多次固定细胞,洗去杂质和细胞碎片,并保证固定充分。每次收获细胞必须使用新鲜配制的固定液,乙酸甲醇均需使用分析纯级别的产品,并按照 1∶3配制。4℃预冷的固定液效果较好。

HANNABI系列的染色体全自动收获仪可设置多个不同细胞收获程序以满足不同类型标本的收获要求,实现了实验操作的智能化,保证收获细胞质量的长期稳定。有条件的实验室可以选择使用。

(三)制片环节

滴片是染色体制备过程中最难把控的环节,也是受操作者经验影响最大的环节。染色体滴片后,随着固定液的挥发,固定液层逐渐变薄,液体的表面张力会将细胞平铺,通过挤压上下层的胞膜将染色体分散开。如干燥速度过快,染色体分散不好,胞浆背景明显,会严重影响后期的显带和染色;而干燥速度过慢,表面张力会将胞膜挤破,使部分染色体游离出细胞区域,造成核型分析时误判为染色体缺失。实验室中的相对湿度、环境温度、空气流动速度等均可影响固定液挥发的速率,造成染色体分散程度以及胞浆背景强弱的差异,影响制片质量的好坏。基于上述理论,各个实验室衍生出了千差万别的滴片方法,但这些方法对操作者个人经验要求相当高,需要非常熟悉各种影响因素,并根据所滴玻片的情况随时进行调整。在此也分享一些滴片的经验。

1.细胞悬液需用新配固定液调到合适的浓度后再进行滴片,滴片前要充分混匀,并尽量去除细胞碎片等杂质。悬液过浓会影响染色体的分散,悬液过稀会增加后期寻找分裂象的工作量。

2.制片室内环境的温度、湿度要控制在合适的范围内,相对湿度在40%~60%,温度在20℃左右。

3.载玻片必须干净,无油腻感,无颗粒。

4.滴片高度的增加可改善染色体的分散。

5.过火需用湿片,数次通过酒精灯火焰上方,通过控制载玻片上固定液挥发的速度,以达到最佳的染色体分散效果。这也是人工操作中难度最大、最难控制均一稳定的环节。滴片室需配备相差显微镜,每份标本应根据相差显微镜下观察到的玻片情况对过火强度随时进行调整。遗憾的是,即使最有经验的操作人员都无法保证每一次均能制备出高质量的染色体玻片。

6.如因天气原因造成连续玻片质量不佳,不应强行继续,应待天气情况适宜时再继续滴片,以免浪费宝贵的骨髓样本。

7.可选用染色体滴片仪提供稳定可控的温度、湿度环境,但需经过充分的预实验来设定合适的参数以达到最理想的分散效果。

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