组织工程学的临床应用

组织工程学的临床应用_组织工程学实验技

组织工程学研究虽然仅经历了10多年的发展历史，却已经完成了大量基础理论、组织构建、动物体内植入等过程。随着细胞学、分子生物学及生物材料研究的突飞猛进，各种组织的组织工程学研究和应用取得了很大的进展，形成了价值达60亿美元的产业，并以每年25%的速度递增。组织工程学的研究领域涉及多种哺乳动物的几乎所有器官的不同组织，组织工程产业已经开始形成。继1997年美国食品药物管理局（FDA）批准的第1个组织工程学产品——组织工程皮肤正式进入临床应用以来，学者们应用组织工程学方法初步构建出的组织工程软骨产品已进入临床试验，组织工程骨产品不久也将面世，组织工程肌腱、血管、肌肉、皮肤、牙周、尿道以及神经组织正在进行体内及临床前期实验；组织工程肝脏、胰腺、乳房、心脏及瓣膜、手指、角膜等均已经取得了可喜的成果，这些将会对组织缺损的修复与再造产生十分深远的影响。尽管目前有关组织工程化组织临床应用的报道不多，但可以预计，在不久的将来，将会有更多、更成熟的组织工程产品应用于临床。以下介绍组织工程化组织临床应用情况。

一、组织工程皮肤的临床应用

覆盖于人体表面的皮肤是人体与外界环境接触的屏障，也是人体面积最大的组织。皮肤不仅对人体起保护作用，而且参与免疫反应和维持内环境稳定。但严重创伤和大面积烧伤患者的自体供皮区不足，而异体皮又存在免疫排斥反应及传播疾病等缺点，解决皮源缺乏一直是临床急需解决的难题。用组织工程学的原理与方法构建或预制皮肤组织是人类由来已久的梦想，也是目前发展较快的一个领域。理想的组织工程皮肤应具备以下特点：能够及时提供、阻止细菌入侵、存放较长时间、防止体液丢失、在创面长期存活、无抗原性、随身体发育而生长，价格适中、应用方便。

早在1951年，就有学者建议用实验室生长的皮肤来治疗烧伤患者，但由于表皮细胞培养困难，此方法未能实施。直到1975年Rheinwald等攻克了体外大规模培养表皮细胞的难关，皮肤替代物的研究和制作才日渐广泛。组织工程皮肤通常可分为表皮替代物、真皮替代物和复合皮肤替代物三个类型。表皮替代物由生长在可降解基质或聚合物膜上的表皮细胞组成；真皮替代物是含有活细胞或不含细胞成分的基质结构，用来诱导成纤维细胞的迁移、增殖和细胞外基质的分泌；复合皮肤替代物则含有以上两种成分，既有表皮结构又有真皮结构。自1997年世界上第一个组织工程皮肤被美国FDA批准上市以来，目前已有Dermagraft－TM、Dermagraft－TC、Apligraft等近20种产品应用于临床。第三军医大学于1997年报道由成纤维细胞、表皮细胞和胶原膜构建的组织工程化皮肤，经过初步临床应用，疗效满意。第三军医大学采用基因方法修饰的猪皮，可在一定程度上克服人体组织的免疫排斥等问题，产品已通过专家鉴定。第四军医大学研制的组织工程化皮肤也已进入临床试验阶段。

目前应用的组织工程化皮肤具有减少烧伤治疗中对供体组织的需求、减轻伤口结痂和收缩、快速覆盖大面积急性伤口、作为传递外界生长因子的载体等优点，因此，临床上不仅可用于大面积烧伤的救治，而且对于较难治愈的溃疡创面，如糖尿病溃疡、静脉性溃疡、压迫性溃疡和放射性溃疡等都有较好的修复效果。

（一）组织工程表皮

组织工程表皮的研究经历了表皮细胞悬液、表皮细胞膜片和表皮细胞－生物材料复合物三个阶段。1975年Rheinwald和Green利用3T3成纤维细胞作为滋养层，建立了表皮角朊细胞培养技术，从人体获取少量皮肤即可培养扩增到足够数量的表皮细胞，并互相融合成薄层皮片，其形态与天然的人表皮极为相似。1979年Green等曾将这种培养的表皮细胞膜片应用于临床，成功地封闭了大面积烧伤患者切痂后的创面。1981年，O′Connor等应用此方法在体外培养出适于移植的人自体表皮细胞膜片，在2例烧伤后的肉芽创面上，培养的表皮细胞膜片附着良好，可以起到创面修复作用，4年后移植的上皮仍可见到。1984年Gallico也有类似治疗烧伤患者并获得成功的报道。1996年Limat等取自体毛囊外根鞘细胞体外培养后移植到小腿溃疡创面，有80%的患者在2～3周内创面愈合，由新生表皮覆盖。新生表皮从生物学标志如角蛋白、纤连素、整合素及形态学方面较周边皮肤无显著差异，创面愈合明显改善。

近十几年来，随着表皮细胞培养技术的不断完善与发展，组织工程表皮主要由生长在可降解基质或聚合物膜片上的表皮细胞组成，在成功救治大面积烧伤患者方面发挥了积极有效的作用，至今仍是公认的治疗方案之一。目前，国外已将体外培养自体表皮细胞膜片技术商品化，只要从患者身上取邮票大小的皮肤组织，分离表皮细胞，经过2～3周培养，表皮细胞便可扩增到100～10　000倍。将这种商品名为Epicel的自体表皮细胞膜片回植到患者的烧伤创面，成功地救治了一些大面积中、重度烧伤的患者，其中包括烧伤面积大于95%的患者。除了烧伤创面之外，自体表皮细胞培养技术在供皮区修复和肢体溃疡治疗方面也得到了成功的应用。

但经过长期的临床观察，发现表皮细胞膜片移植覆盖创面仍存在许多缺点：如耗时长，从取材到培养成完整的膜片需3～4周；细胞膜片菲薄易碎，难于提携；缺乏真皮成分的支持，移植到创面后接受率低，抗感染能力差，极易造成移植物脱失，成活率低；即使在上皮化后，新生表皮弹性欠佳、耐磨性差，容易出现水疱、发生破溃和收缩，造成残余创面，目前其最终成功率仅为50%，限制了其临床应用。为缩短移植准备时间，Prenosil等利用KERATOR——一种自动膜生物反应器（automated　membrane　bioreactor）——来制备自体创面敷料（autologous　wound dressing），其特征是将人角质细胞黏附在亲水性聚合支持膜上并繁殖，形成高活力、未分化的表皮细胞膜片。KERATOR带有显微镜视频系统及图像分析功能，可随时监护细胞成长情况及形态，计算机利用获得的信息可及时调整培养基成分并估算出培养时间，它一次最多可产生0．5m2自体创面敷料，并显著降低成本，减少人为因素的影响，使移植准备时间缩短至2周。此外，利用生物膜作为载体的“激光皮”研究可明显缩短表皮细胞体外培养的成膜时间，而其他表皮细胞－生物材料复合物的研究也取得了一定进展，但目前仍处于实验阶段。为此，人们进一步意识到需在表皮皮层下方增加支持物，方可解决临床上一定厚度、韧性和可操作性的要求。因此，寻找既能支持表皮细胞生长，又便于操作的基质，如胶原、硫酸软骨素、透明质酸膜、纤维蛋白胶以及脱细胞真皮基质等的研究备受关注。

（二）组织工程真皮

组织工程真皮的研究是在组织工程表皮的研究与应用的基础上发展起来的，真皮结构远较表皮复杂。组织工程真皮的基础是二倍体成纤维细胞的培养，含有活细胞或不含细胞成分的基质结构，用来诱导成纤维细胞的迁移、增殖和分泌细胞外基质。真皮替代物在皮肤重建过程中具有重要作用，可增加创面愈合后的皮肤弹性、柔软性及机械耐磨性，减少瘢痕增生，控制痉挛，而且有些真皮替代物中存在的活性成纤维细胞可促进表皮生长分化，诱导基底膜形成。因此，再造真皮基质成为皮肤组织工程学的研究热点。目前正在研制的组织工程真皮基本上可分为两大类，即天然真皮与人工合成真皮，均非真正意义上的真皮，只是起到支撑或框架作用。但由于其植入创面后可诱导体内修复细胞前来定植和发展，形成真皮样结构，故仍将其视为组织工程真皮。

1．天然真皮　天然组织工程真皮具有完整的胶原三维结构，生物相容性好，在组织成分上与自体皮肤最接近，在皮肤重建中具有较高的应用价值。主要包括两类：去除表皮层的异体真皮和无细胞真皮。去除表皮层的异体真皮是将异体真皮植入到创面后去除表皮层，再植入自体厚皮或体外培养的自体细胞膜片重建皮肤。无细胞真皮指通过酶消化、高渗盐水浸泡等去除异体（种）皮中的表皮层和真皮细胞成分，而保留正常的胶原三维结构及基质的真皮支架。

2．人工真皮　人工真皮系采用各种材料制成的真皮基质，与胶原等天然替代物相比其组成成分及胶联物质可改变，以增加对胶原酶的耐受性，且可大量生产，长期贮存。目前，人工合成真皮主要采用聚乳酸、聚羟基乙酸、聚环氧乙烷、聚丁烯对苯二酸酯等人造材料等作为真皮支架，结合成纤维细胞、表皮细胞培养成皮肤替代物，并初步试用于临床取得一定效果。人工真皮可避免使用胶原传播疾病的风险，移植后不引起免疫反应，临床应用表明其抗胶原酶的效果极好；缺点是人工真皮的厚度较难调整；真皮移植后受体的相容性较差，在其上形成的表皮脆性也高。目前，已有五种商品化的人工真皮问世。

（1）Integra：1980年，Yannas等根据创周组织向创面游移的修复细胞可形成真皮层的血管内皮细胞和成纤维细胞这一认识，将牛腱Ⅰ型胶原、葡糖胺聚糖、6－硫酸软骨素共价交联成有一定孔隙的海绵网格，再在其表面涂上一层薄的硅胶膜制成一种两层结构的真皮替代物，外层0．23mm（0．009inch）厚的薄硅胶膜，起临时性的“表皮”作用，可防止体液丧失和微生物入侵；内层为2mm厚的海绵网格。移植于全厚创面后，患者自体内皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞等逐渐从伤口周围长入，形成新的真皮结构，14～46d待真皮部分血管化后，移去上层硅橡胶，即可在新生真皮组织上移植薄层网状自体皮片。创面愈合后，瘢痕形成和挛缩较少，再生的皮肤弹性较高，胶原逐渐被降解吸收，临床应用取得很好疗效，已获美国FDA批准上市，其商品名为“Integra”。随后，Chu等将Integra加以改进，应用一步操作法制成的网状复合皮片，结果表明，一步操作法制成的网状复合皮片能更快愈合伤口，且收缩较少，外形好，比常规的二步操作法更能有效地利用供体皮肤。Boyce等逐渐改进了胶原海绵皮肤的制作方法。胶原海绵真皮的制备、贮存较胶原凝胶简单，其机械强度较高，且胶原海绵的形状，大小和厚度可随意调整。缺点是制备过程中使用的醛类交联剂对组织有毒性，可诱导胶原海绵移植后钙化；使用牛腱胶原有可能引起免疫反应和传播疾病，在制备过程使用的细胞数量也较多。

Dantzer等曾给31例患者的39处创面进行Integra移植，平均每次移植的面积达267cm2，随访0．5～4年，除2例（2处）失访外，其余29例37处中优28处，良6处，差3处。作者认为该材料具有能大量及时应用、操作简单和外观较好等优点，其缺点主要是需二期手术移植自体表皮，住院时间长，并可能出现感染，硅胶膜剥离等。Sheridan在一项回顾性调查中，121例应用Integra的烧伤患者无1例有严重增生性瘢痕形成，7%的患者有中度的增生性瘢痕，其余93%的患者无或仅有轻度瘢痕增生，其中63例患者有涉及关节活动部位的皮肤创伤，在应用Integra治疗后，患者的关节活动功能均良好。

（2）AlloDerm：是由美国Life　Sicence公司生产的一种商品化脱细胞真皮基质。将新鲜尸体皮在1MNaCl中处理15h后撕去表皮，然后在室温下于0．5%SDS连续振摇1h去除细胞成分，PBS清洗后，冻干保存备用。组织学检测见AlloDerm仍保持真皮层的正常结构，免疫组化染色表明基底膜的主要成分——层粘连蛋白仍存在于脱细胞真皮基质表面。异体真皮去除细胞成分，大大降低了免疫原性，但保留了细胞外基质支架和完整的基底膜复合体，可引导新生细胞扩展，与培养的成纤维细胞和表皮细胞结合构成复合膜片。此类人工真皮移植后，其上形成的表皮有网嵴，且此表皮分化、基膜形成和黑色素产生较快。但由于缺乏成纤维细胞成分，移植后患者真皮重建较慢。另外，此种真皮中的异体胶原成分有可能引起患者的免疫排斥反应。Gryskiewicz等应用AlloDerm进行鼻面部的整形取得了较好结果，58例原发和继发性鼻部整形病人采用开放式或鼻内手术方法，在移植物上覆盖AlloDerm进行鼻外形缺陷矫正，42例患者接受了开放式手术，余下16例进行的是鼻内或封闭式手术。其中37例患者是继发性鼻整形患者，有些是多项鼻矫正，长期随访表明尽管发生了部分移植物吸收，但总体结果良好。

（3）Biobrane：它是双层膜状物，外层是薄的硅胶膜，内层整合有大量的胶原颗粒，可以迅速与创面紧密贴附。Biobrane允许创面生理性液体蒸发，防止蛋白质等大分子物质丢失，并能有效减轻疼痛，促进表皮再生及降低脓毒血症发生的风险，长期以来在临床上被用作一种临时性敷料来覆盖大面积的烧伤创面。

（4）Dermagraft－TM：是Advanced　Tissue　Sciences公司生产、1997年获得FDA批准应用于临床的烧伤及慢性皮肤溃疡创面的一种人工真皮。1991年Copper等报道将从新生儿包皮中获取的成纤维细胞接种于生物可吸收的聚乳酸网架上，14～17d后，由于成纤维细胞在网架上大量增殖并分泌多种基质蛋白，如胶原、纤维连接蛋白、蛋白多糖、生长因子等，形成由成纤维细胞、细胞外基质和可降解生物材料构成的人工真皮Dermagraft－TM。其结构更类似天然真皮，能够减少创面收缩，促进表皮黏附和基底膜分化，基底膜可见锚状纤维、层粘连蛋白。在此真皮上可种植角朊细胞，形成完全分化的表皮，但其制备过程中需要大量的成纤维细胞。Dermagraft－TM既可用于烧伤创面，又可用于皮肤慢性溃疡创面的治疗。Gentzkow等多中心研究显示，50例糖尿病患者足部溃疡分别采用Dermagraft－TM及传统的伤口闭合方法进行治疗，结果前者愈合面积及愈合的时间明显优于后者，随访11～22个月，Dermagraft－TM治疗组未再出现溃疡。Marston在美国35个医疗中心314例糖尿病慢性足部溃疡的随机对照临床研究中，进一步证实Dermagraft治疗的安全有效性。

（5）Dermagraft－TC：是Advanced　Tissue　Sciences公司生产的另一种人工真皮。1994年Hansbrough等报道将新生儿包皮的成纤维细胞接种到一种由一层硅胶薄膜和与之相贴的尼龙网组成的膜上。外层的硅胶薄膜发挥表皮的屏障作用，可防止创面水分丢失和环境中细菌侵入。在其尼龙网眼中的来源于新生儿包皮的成纤维细胞在几周后形成致密的细胞层并可分泌胶原、氨基多糖、生长因子等基质成分，可作为一种临时性敷料应用于烧伤创面。研究表明，Dermagraft－TC对烧伤创面的黏附情况以及随后植入其上的表皮细胞膜片的接受率均与尸体皮相似，但由于新生儿成纤维细胞免疫原性很低，这种真皮替代品可用来做异体移植。Purdue等主持的多中心研究显示，66例烧伤患者平均烧伤面积为44%，移植Dermagraft TC与异体皮比较，14d时接受率分别是94．7%与93．1%，从黏附、积脓情况看，两者没有差别，而Dermagraft　TC易于去除，不易造成创面出血。

单纯真皮替代物虽然可达到较为理想的创面暂时覆盖的目的，但由于缺少表皮的防护，使感染概率大为升高。同时，表皮是防止水电解质通过的屏障，可防止体液过量蒸发，真皮替代物由于缺少表皮，可造成体内水电解质代谢紊乱。真皮替代物的另一缺点是外观欠佳，在暴露部位尤为显著。因此，包含自体表皮与真皮、达到永久性创面修复的移植物是更为理想的选择。

（三）组织工程复合皮

完整的皮肤结构是机体抵御外界有害因子的屏障。因此，理想的组织工程皮肤应包含表皮与真皮两层，因为表皮与真皮的解剖形态与生理功能是一个有机的整体。在全层皮肤创面缺乏真皮组织时，仅移植表皮不能获得良好的疗效。表皮与真皮的复合皮片更接近皮肤的解剖与生理。1981年Bell等将表皮膜片与新生儿包皮细胞和真皮成纤维细胞在凝胶中生长形成的真皮相结合，形成复合皮移植获得成功。1988年Boye等将人的成纤维细胞移植到胶原－葡糖胺聚糖（collagen　glycosaminoglcans，GAG）膜上构成一种人工真皮，再在其表面移植表皮细胞，临床应用也获得成功。

1998年由Organogenesis公司注册生产的Apligraf是目前最成熟的既含有表皮层又含有真皮层的组织工程复合皮。Apligraf（开始称为Graftskin）系采用异体成纤维细胞接种于牛胶原凝胶中形成细胞胶原凝胶，1周后接种角质形成细胞，浸没培养4d，角质形成细胞融合成片，然后进行气液界面培养1～2周，即为产品Apligraf，已获美国FDA批准用于治疗静脉性溃疡和糖尿病性溃疡。其细胞成分均来源于新生儿包皮，移植后受体接受率达100%，移植后14d可见连续的基底膜形成，移植后28d，收缩率为39%，表皮细胞分化良好。Casasco等利用免疫组织化学方法和电子显微镜对复合皮肤组织器官和细胞分化进行研究，发现该复合皮肤的表皮层由分层和角化的上皮形成，其细胞含角蛋白，能分化成基底层、棘层、颗粒层及角质层，与天然上皮极为相似。复合皮肤的真皮层为疏松结缔组织，其细胞含有波形蛋白，属于成纤维细胞系。研究中还发现真皮与表皮交界处有不完整的基底膜结构存在。其不足之处是Apligraft制备工艺复杂，在创面维持时间短，创面感染发生率　较高 （可达10．5%），创面收缩率比正常中厚自体皮移植高10%～15%，胶原成分易被胶原酶消化降解等。此外，异体表皮细胞可引起免疫排斥反应等问题，目前尚不能用于大面积深度烧伤创面。

在糖尿病性溃疡目前还缺乏有效治疗手段的情况下，Apligraf是一种非常有用的治疗方法。Veves　A等在美国24个中心观察了208例患者的非感染性神经性糖尿病足部溃疡，试验组112例采用Apligraf治疗，对照组96例采用湿纱布治疗，Apligraf每周用1次，最多4周（5次），如果完全愈合，则停用，创面完全愈合后观察12周；Apligraf治疗患者63例（56%）创面完全愈合，对照组为36例（38%）（P＝0．004　2），平均愈合时间为65d（Apligraf），与对照组90d相比明显缩短（P＝0．002　6）。Apligraf在治疗静脉性溃疡也同样有效。Falanga等在一项临床研究中，Apligraf与传统治疗静脉性溃疡的压迫疗法相比较，6个月治愈率分别为63%和48．8%（P＝0．012）；平均愈合时间分别为61d和181d（P＝0．003）；对于超过6个月的难治性溃疡，Apligraft治疗组愈合时间明显短于对照组（92d／190d，P＝0．001），临床亦未见对同种异体细胞所构建类皮肤的排斥反应。对293例患有静脉性溃疡的患者进行病例对照研究，治疗组146人采用人工皮肤Apligraf覆盖治疗法，63%痊愈，对照组147人仅采用常规包扎治疗法，48．8%痊愈，无统计学差异，但在愈合时间上，治疗组平均为92d，对照组则为190d，差别有显著意义。此外，Apligraf还用于治疗其他一些疾病。Falabella　AF等采用Apligraf治疗了1例大疱性表皮松解症患者，该病临床主要表现为广泛的水疱，可波及口腔生殖器黏膜，严重者发生脓毒血症和死亡。该患者覆盖Apligraf部位的皮肤愈合速度明显快于常规治疗区域，而且治愈后这些部位大多数不再会有水疱复发，抗外伤能力还有所加强。de　Imus　G等应用Apligraf加上环孢素治疗坏疽性脓皮病，能明显减轻疼痛，加速溃疡的愈合，获得了满意的治疗效果。Streit　M等报道1例有25年病史的73岁老年女性溃疡性结节病患者，除皮肤表现外无全身症状，皮肤症状主要表现为红斑，斑块及溃疡，溃疡持续半年未愈。局部用皮质类固醇无效而予Apligraf治疗，溃疡在3个月内愈合，避免了口服皮质类固醇治疗所造成的并发症。

除Apligraf外，Matouskova等创造了一种“颠倒法（Up－side　Down）”新技术，将培养的角朊细胞种植到重组人／脱细胞猪真皮（recombined　human／pig　skin，RHPS）上后，角朊细胞层直接接触创面，而RHPS置于外层起机械保护作用，临床有效率93%以上。1997年王旭等利用新鲜尸体皮制成大的真皮组织，经乙酸提取胶原，氯化钠盐析纯化，冷冻干燥制成固体胶原膜，将异体表皮细胞和成纤维细胞分别直接种植在膜的两面，经培养形成纤维母细胞－胶原膜－表皮细胞夹心式人工复合皮，该复合皮具有一定的机械强度和柔韧性，不易碎裂，便于手术操作。移植于临床修复10例深度烧伤创面，成活7例，随访1年疗效满意，未发现明显排斥现象。但长期疗效尚有待于进一步观察。

随着生命科学、材料科学以及诸多相关科学的飞速发展和组织工程研究的深入，组织工程皮肤除用于临床治疗烧伤及创面慢性溃疡外，还可用于美容、药理及实验研究等领域。构建理想的组织工程皮肤应符合以下要求：具有表皮与真皮两层结构、并引入黑色素细胞和郎格汉斯细胞、甚至含有各种皮肤附件（汗腺、毛囊、皮脂腺等）的完整皮肤，便于手术操作、短期内能获得、移植到创面能够与受体良好贴附，功能与外形近乎正常、更接近人体生理的永久皮肤替代物。目前，选择适宜的细胞外基质和表皮细胞移植方式、通过基因转染缩短表皮细胞培养周期、在皮源极度缺乏、功能部位严重烧伤创面如何有效的修复以及针对不同的临床症状，特别是针对不同病因引起的慢性溃疡，开发最适宜的组织工程皮肤等都将是一个长期而艰巨的任务。

二、组织工程软骨的临床应用

软骨组织的再生能力有限，自体关节软骨细胞移植仅能用于修复关节软骨的小面积缺损。20世纪90年代以来，软骨组织工程的出现为关节软骨缺损的修复提供了一条颇具前途的方法。1992年Vacanti等报道了组织工程化人耳软骨，1993年Puelacher等报道了组织工程化人鼻软骨，1997年Cao等将关节软骨细胞种植在预先塑形的人耳郭形状、涂有PLA的PGA无纺网聚合物支架上，体外培养1周后，再将细胞支架复合物植入裸鼠背部皮下，12周后成功地构建了人耳郭形状新生软骨。这一实验的成功，标志着预制人工软骨的组织工程技术正在走向成熟。目前已经在实验室里成功构建出组织工程人关节软骨、半月板、颞下颌软骨、椎板骨、髓核和韧带等的报道。Mians等用自体软骨细胞移植治疗年轻患者的局部关节软骨缺损，90%的患者症状得到明显改善，术后活检显示有透明软骨修复。Brittberg等通过一组患者66个月随访，发现自体软骨细胞移植后股骨髁缺损处的愈合情况明显优于髌骨缺损处，股骨缺损处的修复组织类似于透明软骨，而髌骨处则为纤维－透明软骨，提示软骨细胞修复缺损的效果与部位有关。

第一例真正意义上的组织工程软骨的临床应用是由Vacanti在20世纪90年代中期报道的。1例12岁男孩，因Poland综合征导致胸骨及肋软骨凹陷畸形，使心肺受到压迫，严重影响心、肺功能。采用自体软骨经过细胞分离、培养、扩增后，与PGA支架复合培养构建成为组织工程软骨，修复了其肋软骨缺损畸形。术后随访4年，患儿由胸廓畸形所致的心肺功能障碍得到有效改善，恢复了正常生活和体育活动，能与正常儿童一样生活和学习。FDA及欧共体在20世纪90年代批准了自体软骨细胞移植修复膝关节软骨小区缺损。方法是通过关节镜检查确诊关节软骨的损伤；在非负重区切取小块软骨，经分离、培养、扩增，制成高密度细胞悬液，再经关节镜技术，切除缺损区软骨达软骨下层；同时切取一片自体胫骨骨膜，缝在缺损区，在骨膜下注入软骨细胞悬液，避免细胞外溢。术后随访最长已超过4年，组织学检查证实为新生透明软骨。这一技术为修复小面积关节软骨缺损提供了新的治疗方法。1999年，Diamond等在内镜下用自体软骨细胞治疗儿童膀胱输尿管反流取得了初步疗效。他们将患者自体耳郭软骨细胞体外培养6周后，在内镜下经尿道将软骨细胞注入膀胱三角区，术后1个月行超声检查，术后3个月进行膀胱造影术，如反流未控制，则进行第2次注射，近期总有效率达83%，无明显并发症。当然其远期疗效尚有待进一步观察。Langer等以细胞种植于肋骨状聚合物支架内，植入患儿体内形成了新软骨。5年后，他具有健康的胸廓。

最近美国Genzyme公司的软骨产品Carticel　TM采用了源自患者损伤膝关节的软骨细胞，将其种植在降解基质中，已获FDA批准进入临床，应用于修复损伤的膝关节软骨。Curis公司利用自体软骨细胞与聚合物水凝胶混合，正在开发注射型产品，而Reprogenesis公司的软骨产品也已进入三期临床试验。

软骨组织没有血管、神经和淋巴分布，其特有的组织器官特异性及生物学特性不仅提供给组织工程化组织良好的研究模型，而且其研究新成果必将促进其他组织和器官的组织工程研究的发展，因此，软骨组织工程研究是当前组织工程研究的热点，也是组织工程学方法成功运用于制造临床移植替代物的出色例子。尽管目前软骨组织工程研究距离有效的临床应用尚有很长的道路要走，但随着有关组织工程化软骨的细胞行为、新型注射基质材料的完善、细胞与材料的优化组合及支架材料的特性以及与软骨形成过程中相关的生长因子等一系列问题的逐渐阐明，软骨组织工程的发展速度和临床应用前景将十分广阔。

三、组织工程骨的临床应用

各种原因导致的骨缺损是临床常见的疾病，也是临床工作的难题之一。应用组织工程技术进行缺损骨组织功能和外形的完善修复，是组织工程学的热点之一。目前临床应用尚处于起步阶段，国内外研究报道不多，仅有一些初步临床应用的报道。

2000年意大利Quarto等报道了3例分别为骨延长失败所致的右胫骨中段4cm骨缺损、右尺骨远段4cm创伤性缺损以及右肱骨粉碎性骨折所致7cm缺失病例，应用自体骨髓基质干细胞和羟基磷灰石构建的组织工程骨修复，取得了成功。经X线照片和CT扫描显示，3例术后2个月沿植入组织工程骨都有丰富的骨痂形成，组织工程骨与宿主骨的界面也已很好骨整合。经术后14～26个月随访，其中2例5个半月及6个月去除外固定，6～7个月内完全恢复肢体功能。另1例由于外固定支架松动，6个月后改用其他外固定，再经6个月后去除外固定，获得功能恢复。2001年Vacanti等报道了1例创伤性左拇指远侧指骨、伸肌腱及背侧皮肤复合组织撕脱伤的病例，用组织工程方法修复后的早、中期效果。伤指用腹部带蒂皮瓣首先修复皮肤缺损，断蒂后用自体左桡骨骨膜来源的成骨细胞经培养扩增后和多孔珊瑚羟基磷灰石预制的指骨形状植入物复合，再植入拇指皮瓣袋内。修复后的拇指恢复了正常的长度、捏拿功能和一定的关节活动度。植入10个月后手术活检显示，5%的植入物有新骨形成。术后28个月随访，X线照片显示指间关节间隙有狭窄，检查拇指的捏压力为正常的25%，指间关节有15°的被动活动度，显示了组织工程骨的临床应用的潜力。最近来自德国的资料显示，采用组织工程技术修复胫骨下端关节面骨－软骨复合组织缺损，早期疗效尚好。

法国报道了一例组织工程下颌骨移植成功的病例。患者是一名9年前因患癌症而被切除了下颌骨的56岁男性，仅能进食流质。由基尔大学的帕特里克·瓦恩克博士领导的外科手术组通过对该患者的影像学检查和面部的三维计算机重建，制作了一个与患者下颌骨形态相似的小钛网骨架，并在网架中填充了小块骨组织、人骨形态发生蛋白及骨髓，随后植入患者背阔肌中。7周后，网架中已经长满了新生骨组织。将该骨组织及与之相连的肌肉、1条动脉和1条静脉取出，通过显微外科方法移植到患者的面部。术后1个月，患者便能使用没有牙齿的组织工程下颌骨咀嚼面包和香肠等食物。瓦恩克希望1年后可以为这名患者取出钛网骨架，使组织工程下颌骨长得更加柔和光滑，以便装上假牙。澳大利亚干细胞专家斯坦·格朗索斯认为，尽管目前随访时间不长，尚不知道新的组织工程骨组织是否与正常下颌骨一样坚韧，但该手术已经明显提高了患者的生活质量。

2000年杨志明等报道了组织工程骨的临床应用成功的病例。1例女性患者，因反复发作的左胸壁巨大韧带样纤维瘤侵蚀了5条肋骨，并压迫肺，与心包粘连，严重影响生活及工作。手术切除后导致5条10cm长肋骨、胸膜及软组织缺损。用自体膈肌瓣修复胸膜缺损；用自体骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨样细胞，与生物衍生支架材料构建3条组织工程骨修复肋骨缺损；用自体同侧侧腹壁皮瓣修复大面积软组织缺损。术后2周心、肺功能改善，1个月后恢复正常农业劳动。随访3年，肿瘤未复发，心肺功能正常。2002年，杨志明等报道应用自体骨髓基质干细胞、同种异体骨膜来源的成骨细胞复合同种异体骨在人体内构建组织工程骨，成功地修复52例患者多个部位的骨缺损与骨不愈合，经过10～28个月、平均18．5个月随访，初步证实组织工程骨具有良好的成骨能力和修复效果，仅有1例骨愈合不良，采用同种异体来源的成骨细胞未发现明显组织排斥反应及其他并发症。在6例术后CD3、CD4、CD8及黏附分子ICAM－1，VCAM－1的检测中，未发现手术前后有任何区别，表明同种异体细胞构建的组织工程骨不发生影响骨愈合的免疫排斥反应。但作者仍指出，异体细胞和该材料存在潜在的免疫排斥反应，目前尚不能作为常规植骨材料广泛应用于临床。沈兵等研究认为，组织工程骨在临床修复四肢骨缺损方面与自体髂骨游离移植相比，在术后反应、骨折愈合时间、功能恢复等方面具有同样的治疗效果，在缩短手术时间和减少出血量方面优于自体髂骨移植。

曹谊林等在前期应用组织工程技术构建并修复羊、狗的颅骨、股骨、齿槽骨缺损的动物实验基础上，首次采用人体自身骨髓基质干细胞为种子细胞，通过体外扩增为成骨细胞，吸附于生物相容性良好并可被机体吸收的生物材料上，培养构建成组织工程化人体骨，临床应用修复20例齿槽裂、梨状孔凹陷、先天性颅面畸形等患者骨缺损。随访最长达2年，均已获得良好治疗效果，并通过组织学检测和CT扫描证实，由骨髓基质干细胞长成的组织工程化骨在人体内形成，并具有良好的组织结构和生理功能。不久前1名儿童因车祸造成颅骨大面积缺损，通过构建的人体颅骨移植修复颅骨缺损，经过4个月的随访，目前这块占颅骨总面积1／6的组织工程化颅骨在人体内稳定存在，生长良好。柴岗等利用培养扩增的第3代自体骨髓基质干细胞与部分脱钙骨复合构建组织工程骨后，用于修复11例颅颌面骨缺损，最大骨缺损面积为6cm2，患者三维CT检查结果显示，术后3～6个月能形成组织工程化骨，并修复骨缺损；术后1～2．5年随访表明组织工程骨稳定存在，无明显骨吸收，临床治疗效果稳定。组织工程骨活检标本HE染色显示其组织结构与正常松质骨相同，并有典型软骨内化骨现象。免疫组织化学染色显示有骨桥蛋白、骨粘连蛋白阳性表达。

目前，组织工程骨组织的临床应用仍处于探索阶段。主要是由于适应临床应用的骨组织工程种子细胞的获取和诱导分化技术流程尚不规范，现有较成熟生物材料的产品转化和临床应用许可证、市场准入证的报批尚需时日；组织工程骨临床应用安全性评价体系和临床效果评价体系等均不完善；自体来源的种子细胞周期较长且受许多限制，同种异体种子细胞尚有许多潜在的缺陷等。因此，只是在具备条件的少数单位，谨慎地选择合适病例进行。

四、其他组织工程化组织的临床应用

1．组织工程角膜的临床应用　1997年，Pellegrini等按照组织工程原理和方法，首次利用干细胞体外培养重建人角膜上皮，并对2例碱烧伤患者施行自体移植。取1mm× 1mm大小的自体健康角膜缘上皮组织，经酶消化分离得到角膜干细胞，体外扩增培养成有功能的角膜上皮细胞层组织，然后，以角膜接触镜为载体，回植于化学烧伤后的眼表面。术后，患者重见光明，患眼视力明显提高。术后眼角膜表面荧光素染色阴性，未见新生血管侵入角膜，免疫组化测定证实角膜上皮细胞特异性角蛋白表达。随访2年，再生的角膜上皮层保持完整、稳定、透明，组织无血管化，达到临床治愈目的。手术的成功使得组织工程角膜上皮移植研究获得了很大突破。但是，该手术周期长，从细胞分离培养至手术约需2周，不少患者在等待中病情加重或发展而丧失角膜上皮移植手术机会。此外，以角膜接触镜为载体的手术，上皮组织转移固定效果很差，降低了手术的成功率。

为克服这些缺点，有学者以羊膜为载体构建工程角膜上皮移植片重建眼表获得成功。羊膜载体具有一定的生物力学特性，能增加组织工程角膜上皮层组织移植手术的可操作性，而且羊膜细胞外基质成分类似于结膜基底膜，能促使角膜上皮细胞的黏附，阻止组织纤维化，促进上皮组织分化。Tsai等取患者健眼角膜缘上皮组织种植于羊膜上，体外培养2～3周后，重建受损伤的角膜表面6例。手术后1个月角膜表面上皮层重建，角膜透明度得到改善。随访15个月，在6例中有5例的视力得到明显提高，另1例由于化学烧伤至角膜完全混浊的患者，视力也有所改善，6例移植区域既无新生血管，也没有炎症反应。Koizumi等将角膜缘干细胞种植在羊膜上，培养2周后行自体回植，术后5d角膜上皮化成功。并且，他们证实去除上皮细胞的羊膜优于角膜基质片和Ⅳ型胶原板层，最适于角膜缘干细胞生长，进而形成与羊膜黏附良好的多层细胞。他们还利用3T3细胞作饲养细胞，将角膜缘干细胞在羊膜上培养4周，移植给干细胞缺乏的眼表皮疾病患者。术后48h形成完整的角膜上皮，大部分患者6个月后形成良好的视觉，1年后随访发现形成透明角膜。Schawb等将自体角膜缘干细胞体外培养扩增后，种植于羊膜上构建角膜上皮，回植治疗19例严重眼表皮损伤患者，效果良好，视力提高。同时又比较了胶原、角膜接触镜、羊膜等载体，同样显示羊膜更能促进上皮细胞生长、黏附。Grueterich等以羊膜为载体体外扩增角膜缘干细胞，修复患眼完全角膜缘干细胞缺乏病例，形成了5～6层完整的角膜上皮，重建上皮的结构和表型近似于正常角膜上皮。眼部严重创伤或疾病可由于角膜干细胞的丢失造成严重的角膜浑浊和视力丧失。最近，Nishida等从4例双侧膜干细胞完全缺乏的患者收集3mm× 3mm口腔黏膜组织，经过体外2周培养形成组织工程上皮细胞膜片，在通过外科手段去除眼表面的结膜纤维血管组织后，将组织工程上皮细胞直接移植到4位患者的各1只眼睛的角膜表面。术后1周均出现角膜的再上皮化，在随后平均14个月的随访中，角膜恢复透明，术后视力明显改善，没有出现任何并发症。

组织工程角膜研究的最终目的是构建一种可移植、易缝合的复合角膜组织，用于临床角膜缺损的修复。虽然组织工程角膜上皮已经应用于临床移植治疗眼表面疾病，而且获得较理想的手术效果，但组织工程复合角膜还停留在体外的构建和基础研究阶段，尚面临许多难题，随着进一步的研究以及组织工程技术的不断发展，体外培养构建生物角膜取代人供体角膜进行角膜移植将成为最有意义和吸引力的挑战。

2．组织工程肌腱、韧带的临床应用2001年杨志明等报道了组织工程肌腱、韧带的临床应用。采用同种异体肌腱细胞接种在碳纤维与PGA复合支架材料上，经体外培养5～7d，植入体内修复喙锁韧带损伤12例，修复跟腱5～7cm缺损7例，全部患者经过平均2年随访，均满意地恢复了功能。为了解植入的人体内同种异体细胞能否在体内长期存活并发挥功能，他们用短串联重复位点检测，证实术后3个月、6个月均有非自体等位基因存在，为杂合态，证实了植入体内的同种异体肌腱细胞存活，并分泌胶原，形成新的韧带和跟腱。

3．组织工程血管的临床应用　2001年，东京女子医科大学的Shinoka等将一体外构建的组织工程肺动脉用于治疗1例先天性单右室和肺动脉闭锁的4岁患儿。该患儿在施行肺动脉成形和Fontan手术后随访中发现肺动脉中段完全阻塞，他们取该患儿外周静脉细胞在体外标准条件下培养1个月后，接种于管状PGA－PHA支架材料上复合培养10d后，构建的组织工程血管用于肺动脉的置换重建获得成功。术后随访7个月组织工程血管仍保持良好的通畅率。这是世界上首例采用自体细胞聚合物构建的组织工程血管用于人体大血管重建，其结果令人激动。2003年，Matsumura等报道将患者自体骨髓基质干细胞作为细胞来源，在手术当天种植到可降解生物材料上，制成了组织工程血管，进行了22例临床试验，没有发生管道的血栓形成和狭窄以及因该项技术而导致的患者死亡。

4．组织工程黏膜　临床上由于各种原因引起的口腔黏膜缺损，目前主要采用自体皮肤或黏膜移植进行修复。但皮肤移植后并不能出现黏膜化生改变，而且移植物与周围黏膜相比，在色泽、质地和功能上仍存在差异。自体黏膜移植虽最适合于口腔自然环境，但供区来源有限。与此同时，无论是自体皮肤还是黏膜移植都会造成新的供移植区创伤。

初步临床应用结果表明，组织工程口腔黏膜移植可长期保存上皮活性，提高受区组织质量和减少供区创伤，可能是较为理想的选择。1990年Luca等最先报道培养人硬腭黏膜上皮细胞获得成功。1991年Ueda等应用牛Ⅰ型胶原和血清混匀成凝胶，作为组织工程黏膜的真皮层替代物。然后取黏膜细胞块置凝胶表面培养4周，即形成双层结构的黏膜。用这种技术修复因行牙槽成形术所造成的3例黏膜缺损的患者，2周后创面被上皮覆盖，受区平坦柔软，与正常黏膜无明显界限，3个月后人工黏膜保持原大小的80%。1995年Raghoebar等采用组织工程黏膜为8例牙槽嵴萎缩的患者行前庭沟加深术，移植的黏膜全部存活。术前3周从患者腭部取黏膜组织，体外培养3周后形成约20cm2黏膜上皮，再移植于口腔创面。3周后受区与周围黏膜外观上无区别，但钉突尚未形成。3个月后组织学检查上皮分化良好，并与真皮层紧密连接，连接靠半桥粒、基底膜、锚定纤维，具备成熟上皮的主要特征，4个月后可观察到钉突形成。2001年Lauer等利用组织工程黏膜对6例口腔鳞状细胞癌患者手术后的口腔黏膜缺损进行修复，其中5例获得满意效果，术后组织检测表明移植黏膜上皮出现分化，并有细胞角蛋白分泌的变化；约在术后18d形成复层上皮，基底膜连续，4～8周后形成20～40层黏膜上皮。移植黏膜上皮有一定程度的收缩，舌仍能获得良好的活动度。用BrdU对移植黏膜上皮标记表明：移植细胞融合到新形成的黏膜上皮中，术后6个月，移植黏膜接近正常。2003年Bodner等采用组织工程化黏膜移植修复11例口腔巨大黏膜缺损患者取得了较为满意的效果。患者平均年龄52．4岁，口腔黏膜缺损平均面积为48．4cm2。手术前数周从患者的健康口腔黏膜取材（0．2～0．5cm2），培养3～4周后即可形成面积达50～250cm2的复层细胞膜片。将其移植于口腔黏膜缺损处。术后1周，移植部位黏膜生长良好并出现角质化，没有感染及瘢痕收缩现象，术后3个月，移植部位完全被健康黏膜覆盖，这些黏膜与周围的黏膜没有明显差别。

五、组织工程器官

由于器官具有非常复杂的结构，与相对简单的组织比较，体外构建完整的组织工程器官仍有许多技术上的困难。组织工程器官将首先作为体外支持系统使用，如临时的助肝装置正在进行临床试验。Neuzil等报道了一例猪肝细胞－中空纤维素移植治疗终末期肝功能衰竭的病例。患者男性，33岁，系酒精性肝硬化合并肝性脑病，且不能耐受肝移植手术，经用肝细胞－中空纤维素移植治疗后，血氨、胆红素水平明显下降，肝性脑病症状得到改善，6个月后进行肝移植，患者获得了新生。Rozga等构建的以猪肝细胞为种子细胞的组织工程肝脏，体外检测表明其具有肝脏的功能，如合成胆红素和特殊的蛋白质，具有细胞P450的活性等。动物体内实验表明其在肝功能衰竭时能进行新陈代谢，并能发挥血流动力学的作用。采用该装置进行7例急性肝功能衰竭肝移植前的替代治疗均取得了成功。目前，组织工程胰、肾、食管、气管、小肠、尿道、生殖器、腺体等的研究方兴未艾，其中部分已进入临床应用前期阶段。随着技术的进步，最终有望在体外构建出可供器官移植的完全生物来源的组织工程器官。

六、展　　望

组织工程学的研究成果将会为临床医学提供工程化组织，以修复组织缺损，重建或改善组织、器官功能。在体外复制有生命的组织，具有重大的科学意义及实践意义，同时也将产生一类新兴产业。组织工程学研究是一项庞大的跨世纪工程，经过10多年研究，得到了迅猛的发展，取得了十分显著的成绩，不仅涉及皮肤、骨、软骨、肌腱等，也涉及到消化管道、泌尿腔道、血管以及肝、胰等实质器官的研究。虽然仍有很多科学问题尚须深入研究，但已有的临床应用结果是令人鼓舞的，并显示出组织工程技术在创伤修复中的巨大潜力。临床应用所获得的良好结果，必将反过来推动基础研究的深入进行，基础研究的成果又为进一步临床应用提供可靠的依据，并使临床应用具有更好的安全性及可靠性。加快组织工程学的研究步伐，早日用优质的组织工程产品造福患者是所有科学研究工作者、临床医学工作者的共同愿望，也当然是组织工程研究的最终目的。因此，今后一段时间内，国内外组织工程研究的总体趋势主要表现在以下几个方面。

1．重视适合临床应用的组织工程主要种子细胞的产业化。在种子细胞体外大规模扩增研究领域、种子细胞的基因修饰研究领域、干细胞定向分化研究领域等，注重关键技术上的突破，建立标准化种子细胞系，并对其临床应用的安全性作出客观评价，使适合临床应用需要的种子细胞达到产业化要求。

2．重视仿生型细胞外支架材料的研制。注重支架材料表面修饰、不同种类支架材料的复合应用，深入研究细胞与支架材料的相互作用机制及其对形成组织工程化组织的影响，构建满足不同组织工程产品的支架材料，并使材料降解速度与细胞功能发挥同步等。

3．重视组织工程医疗产品的标准化研究。对组织工程医疗产品进行科学分类，规范组织工程医疗产品术语；建立生产质量控制体系及配套产品的包装、贮存、运输、复苏技术等；深入研究组织工程产品体内植入后，与受体组织的愈合机制、功能状态、最终结局及检测方法；制定组织工程产品临床前的质量检测标准和生物力学检测体系；科学整合现有的研究成果，制定标准化的临床应用技术操作指南，以利于推广应用。

4．重视组织工程产品临床应用的相关法规建设。制定相应的法律法规来规范组织工程产品的生产、流通和临床应用，使其沿着科学健康的道路发展。

21世纪是生命科学的时代，据初步估计，到2020年，美国组织工程产品市场可达180亿美元。虽然目前组织工程技术的研究和开发费用十分昂贵，但是由于组织工程技术不但可以获得更好的医疗质量，而且通过优化设计，减少由于治疗不佳所产生的额外费用，与传统的治疗方法相比，反而可能降低整个治疗过程的总费用。因此，组织工程技术作为一门新兴生物高技术，具有广阔的应用前景，美国生物学家、诺贝尔奖获得者吉尔伯特认为：“用不了50年，人类将能够培育出人体的所有器官。”这标志着医学将走出器官移植的范畴，步入制造组织和器官的新时代。它是对外科领域中组织器官功能缺损和功能障碍传统治疗方法和模式的一次革命，同时将是21世纪具有巨大潜力的高技术产业，必将产生巨大的社会效益和经济效益。我们相信，随着组织工程学研究不断向深度和广度拓展，人类对组织工程学的了解也将更加全面，人类像在零部件工厂加工一样再造人体组织和器官的梦想也终将会实现。

（南方医科大学南方医院　裴国献　任高宏）

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