易位系的创制与鉴定_关于刘大钧的故事

易位系的创制与鉴定_关于刘大钧的故事

易位系是非同源染色体间染色体片段的互换或近缘物种的异源染色体间片段互换所形成的品系，可以将近缘种染色体上的有利基因转移到栽培种上，起到遗传改良的作用，而避免整条染色体转移所带来的不良副作用。用辐射处理单体异附加系种子，可望异附加染色体和栽培植物染色体发生断裂，相互错接，再将外来附加染色体区段转移到栽培植物染色体上。刘大钧和他的科研团队采用辐射诱变的方法，用对白粉病免疫的6V异代换系与农艺性状优良的小麦品种杂交，并结合用γ-射线辐射处理种子，从其后代中选择出对白粉病免疫的普通小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系。

从1985年起，刘大钧团队每年配制数十个6V异代换系与农艺性状好的普通小麦品种之间杂交组合。杂交结实率较高，一般均在80%以上。F1对白粉病免疫，呈显性（或称上位性），绝大多数F1部分不育，但均可收到自交或回交种子。在F1选出综合性状较突出对白粉病免疫的（“扬麦4号”×异代换系6V）、（“扬麦5号”×异代换系6V）、（“宁8343”×异代换系6V）等组合在F3选抗白粉病株系，取部分种子用钴（60Co）γ-射线，剂量为20000r。辐射后的M1组合条播，M2种穗行和混合群体。在白粉病盛发期选择抗病单株或穗行。以后用系谱法以白粉病抗性为主兼顾农艺性状和其他抗性进行选择。1990年和1991年，刘大钧团队从M3-M5代和F3-F5代近2000个株系中，选出38个抗白粉病株系，从中挑选出100个抗病单株。连续两年分别在温室和田间诱发接种条件下鉴定其白粉病抗性，并进行细胞遗传学分析。1992年从21个株系中鉴定出17个抗病株系含有一对涉及普通小麦与簇毛麦染色体之间的易位染色体，该易位染色体短臂的末端有很深的端带，短臂靠近着丝粒处有一近着丝粒带，在长臂上近着丝粒处有两个弱中间带和一个端带。根据普通小麦“中国春”与簇毛麦的C-带带谱，推测这条易位染色体是簇毛麦6V短臂与普通小麦6A长臂的易位，即6VS/6AL。对上述株系进行连续两年花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ的染色体构型以及C-分带分析等，表明这些株系是细胞学上已基本稳定的纯合易位系（注：DA-016-001，“抗白粉病普通小麦-簇毛麦易位系选育及Pm21基因的染色体定位”研究总结报告。存于南京农业大学档案馆。）。

选育出易位系，并不意味着大功告成，这只是细胞学上基本稳定的易位系，接下来鉴定的过程也充满了挑战。

易位系的鉴定（尤其是小片段易位）一直是外源基因转移过程中一个重要而又困难的环节，但是现在已有许多技术可用于易位系的鉴定。这其中包括经典的细胞学分析，比较成熟的染色体分带技术、同工酶分析以及新兴的分子生物学分析技术（如原位杂交、RFLP分析、RAPD分析）（注：刘大钧：《外源基因在小麦育种中的利用》。《作物杂志》，1994年第42期，第1—7页。）。在鉴定易位系的过程中单凭一种技术很难得出完全正确的结论，需要不同方法之间相互印证、相互补充。另一方面，这些技术的成功利用在某种程度上还必须依靠相应的可供遗传分析利用的材料（尤其是完整的非整体系列）。刘大钧和他的团队综合利用染色体C-分带技术、同工酶分析、非整倍体技术和DNA分子原位杂交等技术。

白粉病抗性的鉴定(www.guayunfan.com)在学生们的眼里，刘大钧只要在办公室里指导学生做实验，看看论文就可以了，其实不然。大田试验是艰苦的，刘大钧总是带头到田间观察、记录。刘大钧的学生吴琴生教授在谈到自己的老师时说，刘大钧刚从校长位上退下来那段时间，还跟他们开玩笑地说：“我也算是做了校长，我的田也荒了，我有时候感到很内疚，很内疚。但是现在我又可以回到田里和你们一起干了，我好开心的。”吴琴生还提到，即使他的老师在当校长期间，他也不是不管麦田，“在他当校长期间，虽然没有以前来的那么多了。但是他一有空就会到田里来，对我们进行指导，我们也受到他很多的教诲。”（注：吴琴生访谈，2013年5月17日，南京。资料存于采集工程数据库。）

从1990—1993年，刘大钧带领课题组分别在南京农业大学田间和温室，通过用混合菌接种诱发鉴定易位系对白粉病的抗性，除1个株系出现抗性分离外，其余16个株系均全部表现免疫。经过全国小麦育种攻关材料创新抗病性指定鉴定单位江苏省农科院植保所和四川省农科院植保所鉴定，普通小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系对白粉病均表现免疫，其中有些品系还兼抗锈病或叶枯病。

细胞遗传学鉴定

20世纪80年代，小麦研究中建立了以DNA分子原位杂交为标志的分子细胞遗传学技术。刘大钧带领课题组将该技术很快应用到课题研究中。如对用C-分带技术鉴定出的易位系，他们进一步用亲本“扬麦5号”和6V代换系以及“中国春”双端二体与易位系测交，对测交后代在花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ观察经C-分带后的染色体配对。在（易位系×6V代换系）F1中，易位染色体的短臂与簇毛麦6V染色体在短臂处相连配成棒状二价体，在（“中国春”双端二体6A×易位系）F1中，6AL与易位染色体配成异型二价体，6AS不参与配对呈单价体，从而进一步证明，这些易位涉及的是6V短臂和6A长臂。

为了确定易位系的易位断点，刘大钧带领课题组利用生物素标记的簇毛麦基因组DNA作探针，普通小麦的基因组DNA作掩盖，对6VS/6AL易位系作进一步的鉴定。通过研究发现，簇毛麦染色体有强杂交信号，用与生物素标记的辣根过氧化物酶检测显棕色，小麦染色体及其片段无杂交信号，且显浅蓝色，易位染色体和易位断点清晰可见，易位断点靠近着丝粒。

同工酶鉴定

通过对整套普通小麦-簇毛麦异附加系和代换系的同工酶分析，观察到抗白粉病的异附加系和代换系均具有对第6部分同源群长臂专化性的簇毛麦的谷草转氨酶特异性酶带（GTO-2），表明导入的携有白粉病抗性基因的染色体是6V。该结果与代换系中小麦与簇毛麦染色体之间代换补偿的C-分带分析结果相吻合（6A被6V代换）。通过对抗白粉病易位系进行的GOT酶分析也显示出，在6V（6A）代换系中具有6V长臂特有的GOT-2酶带，在易位系中则缺失这一酶带，这表明在易位系中缺失了与GOT-2相对应的6V长臂。

分子遗传学鉴定

为了进一步鉴定导入普通小麦中的簇毛麦染色体基因组成，刘大钧于20世纪90年代初期，引进植物病理系毕业的博士李全义，建立分子遗传实验室。他们首先构建了簇毛麦基因组文库，从中筛选出对簇毛麦V染色体组具特异性的重复序列pHv62，该重复序列在簇毛麦基因组中呈串联排列。用pHv62作探针进行Southern杂交，可以在簇毛麦、6V代换系、6VS/6AL易位系上产生杂交信号。由于簇毛麦染色体与普通小麦染色体在一般情况下不发生配对交换，因而pHv62可用作分子标记和跟踪簇毛麦的白粉病抗性基因。

用180个随机引物对普通小麦-簇毛麦抗白粉病易位系进行RAPD分析，在易位系中扩增出多态性DNA片段，其后进一步对簇毛麦6V染色体有特异性的PCR扩增出的多态性DNA片段。在6VS/6AL易位系、6V附加系和6V代换系上都能稳定地观察到这两条特异带，而在其他普通小麦-簇毛麦附加系上则没有出现这样的特异带。

用OPH17引物对（易位系ד扬麦5号”）F1和F2群体进行了RAPD分析，在F1中可观察到OPH17-1900特异带。在被检测的30株F2个体中，有20株具有OPH17-1900特异带，另10株没有。以上结果与用簇毛麦基因组专化性探针pHv62对同一F2群体相同的30株进行的点渍杂交相比完全一致。在温室内用混合菌种对该F2群体进行的白粉病抗性鉴定中，20株具有OPH17-1900特异带的单株均表现抗白粉病。因而足以证明可以用OPH17-1900作为簇毛麦6VS上白粉病抗性基因的分子标记。

通过这样一步一步、有条不紊地扎实工作，先从普通小麦-簇毛麦抗病异代换系与农艺亲本杂交，从其辐射后代中选择抗病单株，用染色体C-分带技术初步鉴定出易位系。再用普通小麦、异代换系及“中国春”双端二体与易位系测交并对测交后代的根尖和花粉母细胞进行染色体C-分带，证明易位涉及到普通小麦的6AL和簇毛麦的6VS；经用同工酶和RFLP分析也验证了该易位片段来自簇毛麦的6V。最后用簇毛麦基因组DNA作为探针进行原位杂交，发现易位系中与簇毛麦6VS有关的染色体臂全部有杂交信号，由此证明易位断裂点靠近着丝粒，该易位为6VS/6AL，对白粉病免疫的基因位于6V短臂上，在此基础上开发出可以快速追踪携带抗病基因外源染色体片断的DNA分子标记。通过以上研究，刘大钧所带领的团队建立了完善的小麦染色体工程和生物技术育种技术体系。

国内外试种鉴定

簇毛麦、硬粒小麦-簇毛麦双二倍体、普通小麦-簇毛麦6V附加系和6V代换系在国内外50多个单位试种鉴定，均表现出高抗白粉病。在国外也是如此。携有6V染色体的附加系和代换系在美国堪萨斯州立大学植病系温室小麦白粉病严重发病的情况下，均表现免疫。在西德的白粉病抗性鉴定中，抗性最好。在6V代换系基础上创制的6VS/6AL易位系与6V附加系、代换系，也同样表现出突出且不同于现有其他白粉病抗源的特点。

1993年7月，第八届国际小麦遗传学会议在北京举行。刘大钧团队带来的文章——Development of T.Aestivum-H.Villosa Translocation Line with Mildew Resistance，这篇论文引起与会人员的高度重视，正式向国际发出声音。经国际小麦基因命名委员会同意（负责人Dr.Mclntosh），将刘大钧团队所创制和鉴定的6VS/6AL上携带的抗白粉病基因正式命名为Pm21。

当时，在小麦中鉴定并正式定名的白粉病抗性基因有20个（Pm1-Pm20），这些基因大部分来自小麦的近缘植物，但这些基因已陆续出现对白粉病抗性的衰退，尤其是上文提到的国内外应用最广、来自黑麦1R的Pm8，由于其抗性丧失，给我国小麦生产带来严重的潜在威胁。国内外遗传育种工作者急切希望找到新的抗白粉病基因。正是在这种情况下，刘大钧团队创制并成功鉴定的抗白粉病基因及时满足了小麦抗病育种的需要。

刘大钧团队的这一研究成果发表在Theoretical and Applied Genetics（TAG，中文名：《理论与应用遗传学》）刊物上，受到国际同行的高度关注。美国、加拿大、德国、意大利、西班牙、荷兰、波兰、捷克、印度共10余个国家的学者前来索要论文，国内外遗传育种单位来函索要易位系。应国内外专家学者的要求，该易位系先后寄发至国内外50多个单位。据国内外一些单位来信反映，该易位系“对白粉病表现出优良的抗性，是一个难得的白粉病新抗源”。有些单位已选育出抗病性突出、农艺性状优良的新品系，认为：“在抗白粉病材料奇缺的情况下，这个珍贵材料，真可谓雪中送炭……”。江苏里下河地区农科所在寄来的应用证明中写到：“我所小麦育种研究室自1993年从南京农业大学细胞遗传研究室引进普通小麦-簇毛麦易位系，并将其对白粉病的抗性向大面积普通小麦品种“扬麦158”、“扬92928”、“扬93-63”等进行回交转育，三年的实践证明：该材料对白粉病抗性能始终保持在免疫水平，是我所多年来引用的10多个对白粉病品种内外抗源性最好的一份材料。而且选育出的抗白粉病材料表现出穗大、长势旺盛，具有较好的适应性。至今尚未发现携带对生产严重不利的性状。普通小麦-簇毛麦易位系在小麦育种上可以被广泛利用，对提高小麦品种对白粉病的抗性以及改善其他农艺性状具有重要的现实意义和巨大的经济意义。”（注：DA-014-004，《普通小麦-簇毛麦抗白粉病易位系发放单位名录》。存于南京农业大学档案馆。）

图8-3　1995年刘大钧（左四）参加Pm21科技成果鉴定会

1989年，国际小麦玉米改良中心前任主任Dr.Fisher和该中心在巴拉圭和土耳其试验站的小麦育种专家在参观南京农业大学细胞遗传研究所后，曾引种普通小麦-簇毛麦6V代换系，经墨西哥小麦玉米改良中心本部、巴拉圭及土耳其试验站试种鉴定，对白粉病免疫。不过，代换系在育种中利用比较困难。1992年，国际小麦玉米改良中心普通小麦研究部主任Dr.Rajaram访华期间，特地到南京农业大学细胞遗传研究所小麦试验田考察小麦-簇毛麦易位系对白粉病抗性情况，并索要易位系种子，回去后经试验站试验鉴定，6VA/6AL易位系表现抗白粉病。该项成果于1996年获得农业部科技进步二等奖和1997年国家技术发明奖三等奖。

图8-4　1989年国际小麦玉米改良中心前任主任Dr.Fisher参观我校江浦农场小麦试验站（左起：刘大钧、陈佩度、Dr.Fisher）