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细菌双杂交技术

时间:2022-02-17 理论教育 版权反馈
【摘要】:目前,人们已经发展了很多酵母双杂交技术的细菌版——细菌双杂交系统。细菌双杂交技术是一种在大肠埃希菌中研究蛋白质相互作用的技术。其中,表达的两个融合蛋白中的一个是由待检测蛋白和已知的DNA结合蛋白融合,而另外一个则是由另一个待查蛋白和细菌的RNA聚合酶融合。在含有这两个报告基因质粒的细胞中,报告基因启动子的转录激活将同时启动上述两个基因的表达。
细菌双杂交技术_医学分子生物学

双杂交是一种体内用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法。目前,人们已经发展了很多酵母双杂交技术的细菌版——细菌双杂交系统。细菌双杂交技术是一种在大肠埃希菌(E.coli)中研究蛋白质相互作用的技术。这套系统主要是基于基因的转录激活原理,通过在细菌体内表达两个融合蛋白,如果二者之间存在相互作用则可以激活报告基因的表达(图9-5)。其中,表达的两个融合蛋白中的一个是由待检测蛋白和已知的DNA结合蛋白融合,而另外一个则是由另一个待查蛋白和细菌的RNA聚合酶融合。目前,这套系统已经可以用于检测众多原核蛋白、真核蛋白之间的相互作用。同样,它也可以用来为某一靶蛋白从复杂的蛋白质文库中来筛选新的相互作用蛋白。

图9-5 细菌双杂交系统原理

在细菌双杂交系统中,待研究蛋白的全长或某些结构域(“饵”蛋白)将被融合到能结合特异DNA序列的DNA结合蛋白结构域上,而另外一个蛋白(“鱼”蛋白)将融合到大肠埃希菌RNA聚合酶的活性亚单位上。一般情况下,使用的DNA结合蛋白是来自λ噬菌体的cI蛋白,而使用的RNA聚合酶的亚单位是α亚单位。当然,其他的一些DNA结合蛋白和RNA聚合酶的亚单位也可以被用作该系统。报告基因质粒中报告基因上游的启动子区域含有λ噬菌体cI蛋白特异结合的DNA序列(OR2),当受到诱导后,λcI融合基因得到表达,所表达的蛋白会结合到OR2上。而含有RNA聚合酶α亚单位的融合蛋白会参与到RNA聚合酶的组装中。如果DNA结合的λcI融合蛋白和α亚单位融合蛋白之间存在相互作用,那么RNA聚合酶将会通过这种相互作用被募集到报告基因的启动子区,从而激活报告基因的转录。在某种程度上说,两者之间相互作用的强弱会影响到下游报告基因的活化程度。

考虑到为使实验结果能够更加的可靠,和许多的酵母双杂交系统一样,在这套系统中一般同时使用两种常用的报告基因:Bla,编码β-内酰胺酶;LacZ,编码β-半乳糖苷酶。在含有这两个报告基因质粒的细胞中,报告基因启动子的转录激活将同时启动上述两个基因的表达。表达的Bla基因将会使细菌细胞具有羧苄西林抗性,而LacZ基因的表达既可以通过β-半乳糖苷酶法来定量分析,也可以通过检测含有X-gal的培养基中细菌克隆的颜色来定量分析。因为该系统中使用了Bla这种选择性基因,从而使得该系统同样适用于为已知蛋白从复杂蛋白文库中筛选新的相互作用蛋白。

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