结构测定方法

（一）一级结构

蛋白质的结构层次中最基础的是其一级结构，蛋白质的一级结构通常是指蛋白质肽链中氨基酸的排列顺序，即氨基酸序列，考虑到由多个亚基组成的蛋白质和结合蛋白质，严格讲蛋白质的一级结构应该是指蛋白质分子内以共价键方式形成的化学结构。

尽管蛋白质一级结构的测定，应该包括肽链中氨基酸残基序列和非氨基酸的其他组分（糖链、脂质以及多种多样的小基团、原子的修饰），但是，目前讨论蛋白质的一级结构仍然是指测定蛋白质的氨基酸残基序列，氨基酸残基序列测定也是鉴定一个蛋白质分子最为可靠的途径。目前测定肽链氨基酸残基序列的方法有化学法、生物学方法和物理学方法三大类。

1．化学法 是最经典的，也是较为可靠的。20世纪40—50年代英国的Francis Sanger实验室首次使用化学法成功测定出第一个完整蛋白质分子的氨基酸序列，很快P．Edman就改进了Sanger的测序法，目前测定肽链氨基酸残基序列多采用的是Edman降解法。尽管各种蛋白质肽链的氨基酸残基序列千差万别，但是，蛋白质化学测序法的策略原则基本不变。其测定步骤如下。

（1）首先是被测样本的分离纯化，以及二巯键的还原等衍生化。

（2）用专一性强的蛋白水解酶，或用化学方法断裂特定的氨基酸残基形成的肽键，得到一组作为降解碎片的肽段。

（3）利用各种类似于蛋白质分离纯化的方法，对一组肽段进行分离纯化。

（4）对分离得到的肽段进行氨基酸残基序列测定。

（5）用另一种降解方法，得到另一组肽段，并测定它们的序列。

（6）利用两组肽段的序列，进行全序列的重叠和连接。

（7）肽链中二巯键的定位。

2．生物学方法 是目前常用的方法。先确定蛋白质肽链的DNA序列，然后再由DNA的碱基序列推出肽链的氨基酸序列。

3．物理学方法 测定氨基酸序列的物理学方法主要有三种：X射线晶体分析、二维核磁共振（NMR）和质谱法（MS）。X射线晶体分析和二维核磁共振不仅可以测定蛋白质的一级结构，同时还可以测定蛋白质的立体结构。在测定分子质量较大的肽链氨基酸残基序列时，质谱法经常需要与化学测定的某些步骤联合使用，如肽链的酶解和所得肽段的分离等。近年，人们建立了基于串联质谱技术的氨基酸测序方法。这是根据质谱技术测定多肽分子质量的极高准确性而设计的，即通过质谱技术先测定某一肽段以及从C-末端或N-末端去除一个残基的同一肽段各自的分子量，二者之差值即为末端残基的分子量，然后与20种标准氨基酸的分子量进行比较就可以确定末端氨基酸的本质了。实际操作中，从质谱上获得的一系列多肽片段依次相差一个氨基酸，我们可以很快地确定最初样品多肽的末端序列。

另外，除细胞质中的蛋白质外，几乎所有的蛋白质都含有二巯键。因此，在测定了肽链中氨基酸残基的序列后，还应测定肽链中的二巯键。经典的二巯键测定的方法是借助于对角线电泳。其基本原理是：未经还原的完整肽链经酶切后可得到的一组肽段，其中有一些是由二巯键连接而成的“工”字形肽段。这组肽段在滤纸上进行第一次电泳后，设法将二巯键断裂，如用甲酸蒸汽处理，再将滤纸转90°进行第二次电泳。应为两次电泳的条件相同，“工”字形肽段以外的所有肽段，在两次电泳后位于滤纸的对角线上，只有“工”字形肽段因二巯键断裂称为两条肽段，而且会在第二次电泳后偏离对角线。从滤纸上取下偏离对角线各个成对的两条肽段，分别测定它们的氨基酸组成或氨基酸残基序列，由此推断肽链内或肽链间的二巯键。

（二）蛋白质的空间结构

测定蛋白质空间结构最为成熟的方法是X射线晶体衍射法。绝大多数已经获得的蛋白质空间结构（包括第一个空间结构被测定的蛋白，肌红蛋白）都是通过此方法测定的。

1．X射线晶体衍射法 早在20世纪30年代就利用X射线晶体衍射法研究蛋白质的结构。其原理是：首先，纯化的蛋白质分子在合适的环境中进行高度有序的排列而形成所谓的单晶。然后用一束X射线照射蛋白晶体中按同样方式排列的巨大数目的蛋白分子。一部分射线将在与蛋白分子中精确排列原子的电子云发生相互作用后散射，或说衍射。如果在距离蛋白晶体一定的位置上放置一个对X射线敏感的电子探测器，则可以得到一个反映蛋白质分子中不同原子排列方式的衍射图，通过利用计算机软件将衍射图进行复杂的数学处理后转换成一电子密度图，根据所得到的电子密度图即可解出晶体蛋白分子中的每一个原子的排列方式。

X射线晶体衍射法分析一般认为是用于测定蛋白质的三级结构，不过它也可结合其他技术用于测定蛋白质各层次结构以及和其他分子相互作用的情况。对于具有四级结构的蛋白质X射线晶体衍射技术除了可以揭示蛋白质中亚基的空间结构外，还可测定各亚基间的相对布局，具有四级结构蛋白质所呈现的变构效应也全是由X射线晶体衍射技术所揭示的。

2．二维核磁共振技术 NMR是另一种测定蛋白质空间结构的方法。2002年为了表彰在NMR研究方面的成绩，瑞士科学家Wüthrich获得了诺贝尔奖。与X射线晶体衍射法不同，被测定的样本无需结晶，但样本要求纯度高；测定时样本的浓度要高；被测蛋白质的分子量不能太高。该技术利用的是处于一定空间距离范围之内存在相互作用的两个或多个自旋核磁矩不为零的原子核之间在外加一定磁场的作用下各自产生的自旋磁场之间相互影响的现象；并以此判断两个原子之间的空间关系。在蛋白分子测定中常用的一般是氢原子，由于只有空间上相邻的氢原子才会相互作用，所以得到的实际上是一个氢原子接触图。

3．蛋白质构象变化的追踪 蛋白质分子在折叠、去折叠过程中，在与其他分子发生相互作用的时候都会发生构象的调整。这些变化一般可通过圆二色谱（circular dichrooism，CD）等方法来探测。

（1）圆二色谱法：从本质上说，圆二色谱探测的是蛋白质分子的不对称性。蛋白质分子的不对称性来自两个方面：一是不对称碳的大量存在而导致的“构型不对称性”，另一方面是不对称空间结构（如α-螺旋、β-折叠、β-转角等结构）的存在而导致的“构象不对称性”。因为这种结构特征，当两束偏振方向分别为左旋和右旋的光线通过蛋白溶液时，这两束偏振光的吸收率（即透射出来的光与入射进去的光强度的比例）是不同的。不同波长处这两种偏振光的吸收率的差值反映蛋白构象组成情况。蛋白质分子构象的变化也可以通过观察这种吸收率的变化而追踪。

（2）红外光谱（IR）和拉曼光谱：蛋白质中不同的原子和不同的键均对应着不同特征的红外光谱和拉曼光谱，可以从不同角度对蛋白质分子构象的变化进行定性或定量探测。