腐植酸荧光特性及生物农药制备的研究

腐植酸荧光特性及生物农药制备的研究_2015年论文集

腐植酸荧光特性及生物农药制备的研究

方冬冬　王　杰　周霞萍

(华东理工大学资源与环境工程学院　上海　200237)

摘　要：腐植酸作为一种生物大分子物质普遍存在于自然界中，泥炭和褐煤是腐植酸的主要来源之一。通过荧光光谱分析，腐植酸荧光发射光谱表现为宽平峰，泥炭腐植酸和褐煤腐植酸的官能团结构相似。腐植酸具有多种生物活性组分，利用分枝杆菌定向降解得到甾类化合物，酵母菌异源合成得到腐植酸萜类，通过浓缩、分离、纯化等处理工艺，可以用来制备生物农药，具有抗菌，改善植物营养条件的作用。

关键词：腐植酸　荧光　分枝杆菌　降解　生物农药

Fluorescence Characteristics and Biological Pesticide Research on Humic Acid

Fang Dongdong,Wang Jie,Zhou Xiaping

(College of Resource and Environmental Engineering,East China University of Science and

Technology,Shanghai,200237)

Abstract: Humic acids are biological macromolecular substances existed in nature,mainly derived from peat and lignite.Through the fluorescence spectrum analysis,fluorescence emission spectrum of humic acids were characterized by wide flat peak,also the functional groups of humic acids from peat and lignite were similar.Humic acids have many biological active ingredients.Steroid compounds could be obtained by mycobacteria directional degradation,and humic acid terpenoids could be obtained through heterologous biosynthesis by saccharomycetes.The fermented products were antimicrobial,and can improve the conditions of plant nutrition.Through the enrichment,separation and purification processes,they can be used as biological pesticide.

Key words: humic acid;fluorescence;mycobacteria;degradation;biological pesticide

农业是我国经济基础组成部分，在经济增长、生态平衡方面起着重要作用。近年来，化学农药在农业上的应用日益广泛，传统化学农药的长期使用不仅严重污染环境，降低农产品的品质，给人们的身体健康带来严重的威胁，而且害虫抗药性问题也越来越严重[1]。因此，需要环境友好型农药来替代化学农药，生产高数量、高品质的农产品。

腐植酸是动植物残体在微生物作用下经过生物化学和地球化学等一系列复杂过程得到的生物大分子化合物，具有亲水基团、疏水基团。其以苯环为基本结构，苯环上带有酚、醛、酮、酯、羧酸等官能团，还存在一些含氮杂环、链烃、多环环烷烃等物质[2]。现有研究中，表征腐植酸的常用方法有紫外-可见光谱、红外光谱、荧光光谱、核磁共振、表面增强拉曼光谱、透射电镜和原子力显微镜分析等[3]。其中，分子荧光光谱根据物质的不同结构特性，产生不同荧光现象，将其应用在腐植酸性质表征中，具有灵敏度高、选择性好、分析方法简便的特点。

[收稿日期]2015-11-02

[作者简介]方冬冬，女，1992年生，硕士研究生，主要研究方向为腐植酸物理化学性质及生物农药的制备，E-mail：dxxsmonkey@126.com。

萜类和甾类物质广泛存在于自然界中，具有多种生理活性。其中，单萜类、倍半萜类、植物甾体类化合物具有抗菌、消炎、抗病毒活性[4]，是开发医药、农药的良好原材料。现有研究中，腐植酸作为肥料在农业生产中的应用已较为广泛，而应用至生物农药的实例并不常见。腐植酸中含有萜类、甾类等生物活性组分，可以通过微生物降解转化腐植酸以及异源合成途径，得到萜类、甾类及其衍生物，作为生物农药的组成部分，具有抑制有害菌群生长、改善自然界碳循环的作用。

裂解-气相色谱-质谱联用技术被应用于腐植酸大分子的结构组成特征研究。但是，直接用气相色谱-质谱联用(GC/MS)技术研究腐植酸的组成特征还是比较少的[5]，这是由于腐植酸的组成比较复杂，没有固定的元素组成以及固定的结构，常规的GC/MS并不能很好地检测出腐植酸的化学组分。

通过分子荧光光谱对腐植酸、棕腐酸和黄腐酸进行表征，着重研究了工程化分枝杆菌对腐植酸的定向降解，降解产物腐植酸甾类的成分和性质，以及酵母菌对腐植酸萜类的异源合成作用。在萜类、甾类医药研究的基础上[6]，进行腐植酸生物农药的制备。

1　材料与方法

1.1　供试材料

泥炭和褐煤：均取自云南，其工业分析和元素分析见表1；

秸秆：取自上海崇明农场，风干；

乙醇、乙酸乙酯、葡萄糖等试剂：均采用华东理工大学采购的分析纯药品；

分枝杆菌：由华东理工大学鲁华生物技术研究所提供的工程菌株；

酵母菌：由上海立波啤酒厂提供。

表1　原料分析
Tab.1 Analysis of raw materials

1.2　腐植酸的化学表征

根据在不同溶剂中的溶解度，将腐植酸分为黄腐酸、黑腐酸和棕腐酸。实验采用不同溶剂对泥炭、褐煤进行溶解，超声波振荡，过滤，精制。所得样品通过Varian Cary 60型紫外-可见分光光度计，确定激发波长，再用分子荧光光谱仪测定荧光强度，扫描速度为1000nm/min，扫描光谱仪器自动进行校正。

1.3　腐植酸甾类、萜类的分析

1.3.1　腐植酸甾类的分析

实验选用工程化分枝杆菌(菌株培养至OD600为2～3，甘油浓度50%，于-40℃冻存)，通过种子培养基活化，接种活化后的分枝杆菌于30mL培养基中，加入灭菌后的腐植酸，在温度为30℃，转速200 r/min的摇床上培养7天。降解完全后，取500 μL降解产物于洁净的离心管中，加入250 μL乙酸乙酯，充分振荡，离心9000 rpm、3 min，萃取液通过Agilent 6890-5973N，HP-5MS色谱柱(30m×250 μm×0.25 μm)，气化温度为280℃，载气流速 0.7 mL/min，进样量1 μL，质谱电子能量70 eV，扫描质量范围(m/z)33～500。

1.3.2　腐植酸萜类的分析

酵母菌作为真菌，具有成熟的真核表达系统，其甲羟戊酸途径为异源萜类化合物的合成提供了前体，通过甲羟戊酸途径，酵母菌可以高效合成萜类化合物。利用秸秆和果皮作为原料，在一定的温度下，通过酵母菌异源合成腐植酸萜类，确定腐植酸萜类的主要成分，并比较不同浓度腐植酸萜类对胶孢炭疽菌的抑制作用。

2　结果与讨论

2.1　腐植酸的荧光性质表征

腐植酸分子中含有大量的苯环、稠苯环和杂环，各环之间以桥键相连，环及支链上有羧基、酚羟基、醌基、甲氧基等各种官能团，具有较特殊的荧光性质。

图1是精制后的泥炭腐植酸荧光图，可以看出不同浓度腐植酸的荧光峰具有较好的对称性。随着浓度的增加，腐植酸的荧光强度增加，溶液中的荧光基团也增多，浓度达到一定程度时，腐植酸分子聚集，导致荧光自猝灭[7]。激发波长也会随浓度的增大而增大，出现轻微的红移[8]。实验选用0.01%泥炭、褐煤与溶剂混合。根据紫外-可见吸收光谱，确定泥炭腐植酸的最大激发波长是273 nm，褐煤腐植酸的最大激发波长是274 nm。

图1　不同浓度泥炭腐植酸荧光图
Fig.1 Fluorescence spectra of different concentrations of humic acids from peat

除了浓度的影响外，温度和pH值对腐植酸的荧光强度也有一定的影响。当温度升高时，分子运动速度加快，分子间碰撞概率增加，使无辐射跃迁增加，腐植酸的荧光强度降低。同时，在不同酸度中分子和离子间的平衡改变，因此pH值不同，荧光强度也有差异。

图2中腐植酸的荧光发射光谱表现为宽平峰，峰值出现在450～480nm之间，这是由于腐植酸具有多种荧光发色基团[9]。图中545 nm处为瑞利散射的倍频峰。从图2棕腐酸的荧光图可以看出，泥炭和褐煤棕腐酸在360nm左右有荧光峰，而黄腐酸没有，其余的荧光峰与黄腐酸相似，可能由于黄腐酸一部分溶于醇，致使棕腐酸精制样品中含有一部分黄腐酸。从图中还可以看出，泥炭和褐煤的黄腐酸荧光光谱也有极高的相似性。黄腐酸的发光峰相对于棕腐酸有稍微红移，这是由于极性分子电子云对荧光分子的影响，π→π*跃迁需要的能量差ΔE减小，而且跃迁概率增加，荧光光谱往往会发生红移，甚至猝灭。

图2　腐植酸、棕腐酸和黄腐酸的荧光图
Fig.2 Fluorescence spectra of humic acids,hymatomelanic acids and fulvic acids

2.2　腐植酸甾类农药的分析及制备

腐植酸具有多种生物活性成分，本研究通过分枝杆菌定向降解，得到结果如图3所示。

图3　微生物降解前后GC/MS分析
Fig.3 GC/MS analysis of samples before and after the microbial degradation

图3显示的是腐植酸降解前后的色谱总离子流图。在降解产物中共检测出20多种物质，包括烷烃、有机酸、酮、醇、酯、萜类和甾类化合物。根据峰面积归一化法测定各成分的相对百分含量。相比腐植酸降解前，定向降解后的萃取液中检出多种新物质，其保留时间在25min左右，分子量在239～446，这些小分子物质是由腐植酸中的大分子物质经分枝杆菌降解生成的。

烷基取代苯酚是腐植酸中常见的化合物，一般认为苯酚类物质可能来源于蛋白质、聚羧酸、碳水化合物或木质素。降解前，保留时间为15.62 min的物质为2,4-二叔丁基苯酚，相对含量为1.15%，降解后，其相对含量为2.46%，这表明腐植酸在分枝杆菌定向降解过程中，能有效的被分枝杆菌利用而分解，同时有2,4-二叔丁基苯酚的生成。张新慧等[10]研究2,4-二叔丁基苯酚对植物根际微生物生长的影响，发现低浓度的2,4-二叔丁基苯酚能够促进土壤微生物数量的显著增加。

降解产物中检出一些含氮物质，表明氨基酸、蛋白质和多糖等物质参与了腐植酸的形成过程，这些含氮物质可以为植物提供营养，促进植物生长。在保留时间为21.66 min处，检出有泪杉醇，相对含量为2.27%，这是一种双环二萜类化合物，这些腐植酸萜类可以干扰细菌代谢，达到抗菌效果。同时，在保留时间为24.49 min处，检出有类似豆甾醇结构的物质，在农业生产中，豆甾醇可以作为大规模合成的农业除草剂和杀虫剂原料，抑制黄瓜炭疽病、小麦赤霉病、玉米大斑病孢子萌发，同时还能较好地抑制番茄灰霉病菌丝的生长[11]。

麦角甾类也从降解产物中检出，作为农药，其抑制剂活性高、不易产生抗药性。烯唑醇和咪鲜胺等麦角甾醇脱甲基抑制剂对葡萄胶孢炭疽菌具有敏感性，供试茵株对咪鲜胺的EC50值在0.01～1.58mg/L之间，高于其对烯唑醇(EC50 0.05～25.45mg/L)的敏感性。田间试验表明，科学合理地应用麦角甾醇脱甲基抑制剂防治葡萄炭疽病，可延缓或避免菌株抗药性的产生，减小对潜在抗性菌株的选择性压力[12]。

分枝杆菌定向降解腐植酸得到的甾类，经浓缩、分离、纯化等过程可以得到甾类原药。向甾类原药中加入惰性填料和一定量的分散剂，按比例经充分混合粉碎后，达到一定粉粒细度。这些粉状农药可以直接施于植物根部，被根系吸收，也可加水湿润、分散，喷洒施用。粉状甾类农药具有储运方便、安全的特点，包装材料容易处理，对植物也较安全。

2.3　腐植酸萜类农药的分析及制备

酵母菌对秸秆、果皮进行降解转化，异源合成萜类化合物，其形态可以直接在显微镜下观察，得到的萜类化合物如图4所示

图4　腐植酸萜类化合物结构图
Fig.4 Structure diagrams of terpenoids in humic acids

以秸秆、果皮为原料异源合成并衍生化的腐植酸萜类组分，在30℃下，以活菌对照106　cfu/mL为准，经过8 h的抑制时间，不同浓度腐植酸萜类对胶孢炭疽菌的抑制率见表2。可以看出，随着腐植酸萜类浓度的升高，其对胶孢炭疽菌的抑制率先升高后下降，其中以0.005 μg/mL的腐植酸萜类对胶孢炭疽菌的抑制效果最好，抑制率为95.7%。

表2　不同浓度腐植酸萜类对胶孢炭疽菌的抑制率
Tab.2 Inhibition rates of different concentrations of terpenoids in humic acids upon colletotrichum gloeosporioides

腐植酸萜类亲脂性强，可以透过细胞膜，进入到细胞内，影响细胞膜的结构和功能，干扰病原微生物的正常生理代谢，对病原微生物起到防御作用。王海斌等[13]研究表明，腐植酸含氧单萜类物质对稗草具有抑制作用，不同物质处在不同浓度时，对抑草效应的贡献程度存在差异，几种萜类物质组合后对稗草的最高抑制率为93.96%，在抑草效应上具有协同作用。

酵母菌异源合成得到的腐植酸萜类，经浓缩、分离、纯化等过程可以得到萜类原药[14]。向原药中加入非离子表面活性剂，如吐温、脂肪胺、甘油脂肪酸酯类，以水为介质，超微粉碎制成黏稠可流动的悬浮液，喷洒于作物表面上，可以吸附于微粒表面形成不同的分散体系，改善植物叶片上生物农药的分布和渗透，提高利用率。

3　结论

(1)通过荧光光谱表征，纯化后的腐植酸荧光峰有较好的对称性，荧光发射光谱表现为宽平峰。

(2)分枝杆菌定向降解腐植酸得到20多种物质，其中的甾类化合物包括豆甾醇衍生物以及麦角甾醇等。

(3)通过酵母菌的异源合成作用，腐植酸中的萜类化合物有所增加，对胶孢炭疽菌的抑制率最高达95.7%。

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