真核微生物的基因重组

在真核微生物中，基因重组主要有有性杂交、准性杂交、原生质体融合和转化等形式。

（一）有性杂交

杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重组方式。有性杂交一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组并产生新遗传型后代的一种育种技术。凡能发生有性孢子的酵母菌或霉菌，原则上都可应用与高等动、植物杂交育种相似的有性杂交方法进行育种。

例如啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），从自然界中分离到的或在工业生产中应用的酵母，一般都是其双倍体细胞。将生产不同性状的A、B两个亲本菌株（双倍体）分别接种到含醋酸钠等产孢子培养基斜面上，使其产生子囊，经过减数分裂后，在每个子囊内会形成4个子囊孢子（单倍体）。用蒸馏水洗下子囊，经机械法（加硅藻土和石蜡油，在匀浆管中研磨）或酶法（用蜗牛酶等处理）破坏子囊，再行离心，然后将获得的子囊孢子涂布平板，就可得到由单倍体细胞组成的菌落。把两个不同亲本的不同性别的单倍体细胞通过离心等形式密集接触，就有更多的机会出现双倍体的有性杂交后代。有了各种双倍体的杂交子代后，就可从中筛选出优良性状的个体。

（二）丝状真菌的准性生殖

准性生殖（parasexual reproduction或parasexuality）是一种类似于有性生殖但比有性生殖更为原始的一种生殖方式，它可使同种生物两个不同菌株的体细胞发生融合，且不经过减数分裂的方式而导致低频率基因重组并产生重组子。准性生殖常见于某些丝状真菌，尤其是半知菌中。

（1）菌丝联结（amastomosis） 它发生于一些形态上没有区别但在遗传性上却有差别的同一菌种的两个菌株的体细胞（单倍体）间。发生联结的频率极低。

（2）形成异核体（heterocaryon） 两个体细胞经联结后，使原有的两个单倍体核集中到同一个细胞中，于是就形成了双核的异核体。异核体能独立生活。

（3）核融合（nuclear fusion）或核配（caryogamy） 在异核体中的双核，偶尔可以发生核融合，产生双倍体杂合子核。如构巢曲霉（Aspergillus nidulans）或米曲霉（A.oryzae）核融合的频率为10－5～10－7。某些理化因素如樟脑蒸汽、紫外线或高温等处理，可以提高核融合的频率。

（4）体细胞交换（somatic crossing-over）和单倍体化 体细胞交换即体细胞中染色体间的交换，也称有丝分裂交换（mitotic crossing-over）。上述双倍体杂合子的遗传性状极不稳定，在其进行有丝分裂过程中，其中极少数核的染色体会发生交换和单倍体化，从而形成极个别的具有新性状的单倍体杂合子。如果对双倍体杂合子用紫外线、γ射线或氮芥等进行处理，就会促进染色体断裂、畸变或导致染色体在两个子细胞中分配不均，因而有可能产生各种不同性状组合的单倍体杂合子。

（三）酵母菌染色体外的DNA

1.2μm质粒（2μm plasmid）

酵母菌细胞内有一种长约为2μm长的DNA片段，现称为2μm质粒（2μm plasmid）。在不同酵母菌种细胞中的2μm DNA限制性图谱不同，但具有某些共同特性：都为闭合环状DNA分子，长度基本一致，但在细胞中的拷贝数量高达60～100个，DNA量可占细胞总DNA量的1／3左右；都含有约为600bp长度的一对反向重复序列，并以2种异构体形式存在，仅携带有与复制和重组有关的4个蛋白质基因而不携带有编码其他表型性状的基因，即为隐性基因。2μm质粒是酵母菌中进行分子克隆和基因工程的重要载体。

2.线粒体DNA

线粒体（mitochodrion）是真核生物的重要细胞器。酵母菌所含的线粒体DNA（mtDNA）携带有可以编码细胞色素b、细胞色素c氧化酶、ATP酶和一种核糖体tRNA等的基因，且含有多个复制原点，在DNA复制起始区域有大量的间插序列和内含子，而在其他区域基因之间无间隔区域或内含子，基因间有相互重叠。这些基因特性对于进行基因重组具有重要的潜在价值。