（一）研究对象选择
不同组织、同一组织在不同的发育阶段、同一组织处于不同的状态时（比如营养状态、疾病状态等）所含蛋白质的种类和每一种蛋白质的含量都是不同的。但是有一点是相同的，那就是无论任何来源的生物材料一般都含有成千上万种不同的蛋白质分子。每一种蛋白质本身具有结构以及时空表达的多样性，因此蛋白质的研究往往是那些在组织中含量比较高，相对比较稳定的蛋白质（如血液中的血红蛋白是被研究的历史最悠久的蛋白之一；肌肉中的肌球蛋白和肌动蛋白等），从模式生物基因组测序结果来看，每一种生物体内都含有大量的蛋白质（一般占总蛋白数目的50%）从来没有被研究过，研究“未知蛋白”可以为我们展现更巨大的舞台，也可能会给我们带来更多的意外惊喜。
蛋白质研究的对象主要有两种：一是直接从生物组织中提取纯化蛋白；二是根据基因组测序结果获得有关基因的cDNA，然后通过重组DNA技术表达重组蛋白，但是后者根据基因组测序结果推出的结构可能会与生物体内真实存在的有偏差，甚至完全是假象，即使推测得到的蛋白质编码信息是对的，在细胞内还存在转录后及翻译后的加工修饰等基因序列上目前还无法反映的信息，所以，目前常用的蛋白质研究对象主要来源于从生物体直接提取纯化。
（二）细胞的破碎
如果需要的蛋白质是胞内蛋白，收集细胞或组织后首先进行的就是细胞的破碎。大多数哺乳动物细胞或组织相对容易破碎，动物细胞不像细菌或植物细胞，不具有起保护作用的细胞壁，多数技术都是物理性破坏细胞膜。微生物细胞壁的存在使微生物细胞的破碎较难，应用一些化学、物理和酶学的方法较为行之有效。现在常用的细胞破碎的方法主要有以下两种。
1．超声破碎 用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧振荡破裂（借助超声波的震动力破碎细胞壁和细胞器）。其机制可能与强超声波作用溶液时，气泡产生、长大和破碎的空化现象有关。空化现象引起的冲击波和剪切力使细胞破碎裂解。超声波破碎的效率取决于声频声能、处理时间、细胞浓度和细胞类型等。使用时注意保持低温，防止过热。
2．高压破碎 这是一种温和的、彻底破碎细胞的较为理想的方法。细胞悬液从高压室的环状隙高速喷射到静止的撞击环上，被迫改变方向经出口管流出。此过程中细胞经历了高速造成的剪切、碰撞及高压到常压的变化，从而破碎释放内含物。
（三）去污剂处理溶解膜蛋白
真核细胞具有一个复杂的膜系统，很多蛋白质分子或蛋白质复合体都是整合在膜上的。如果要纯化的蛋白质是整合在膜上的跨膜蛋白的话，一般都需要去污剂。去污剂是一类具有一亲水性头部和有疏水性尾巴的双亲性脂类分子，他们既可以破坏细胞的磷脂双层结构，又可以与具有疏水性表面的膜蛋白结合，从而阻止释放出来的膜蛋白通过疏水相互作用形成大的、可沉淀的聚集体。外周蛋白仅仅是通过非共价键的弱相互作用附着在膜的外表面，一般利用高盐溶液就可以洗脱下来，不必使用去污剂。
有的去污剂的亲水性头部可离子化（即含有一带电基团），如脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠（SDS）（图6-1）等；有的去污剂则不能解离，所以分子中缺少带电基团，如辛基葡萄糖苷等。
图6-1 SDS的结构
每一种去污剂都具有一特征性的所谓临界微团浓度（CMC）。当去污剂浓度低于此值时，去污剂分子在水溶液中将不形成微团，达到此值时，微团开始形成。每一种去污剂的CMC值与其分子中疏水部分与亲水部分的结构有关。
一般来说，像SDS这样的离子化去污剂既能通过其“疏水尾巴”破坏蛋白质分子的疏水部分的结构，又能够通过其带电的“头部”破坏蛋白质分子中的氢键和离子键。所以SDS作用的是使任何蛋白（不管是膜蛋白还是水溶性蛋白）都发生完全变性，并溶解在水溶液中，同时失去生物活性。在部分情况下，当去污剂被透析后，蛋白质可以复性并恢复生物活性。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）就是利用SDS的这种性质发挥作用的。
非离子去污剂相对就更为温和，一般不会使蛋白质变性。只是将蛋白质分子从膜上溶解下来而已。当去污剂浓度低于其CMC值时，去污剂分子与膜蛋白表面的疏水区域结合，使蛋白质在水溶液中溶解而不聚集。当去污剂浓度等于或高于CMC值时，去污剂分子将与膜磷脂一起形成混合微团，膜蛋白以整合在微团中的形式存在。所以，如果我们希望纯化后的膜蛋白保持生物活性的话，一般选择非离子去污剂（图6-2）。
（四）细胞释放的蛋白质分子的稳定
一般而言，从细胞中释放出来的蛋白质分子是相对脆弱的，需要通过以下的操作使之稳定，如在缓冲液中加入蛋白酶抑制药、在低温下操作，加入像甘油那样的稳定剂等。当然也有少数蛋白是很坚强的，无需稳定处理。
（五）细胞碎片的去除
图6-2 非离子去污剂处理溶解膜蛋白
去除细胞碎片是蛋白质纯化的第一步，通常采用离心法处理。其总的原理是：悬浮在溶液中的两个或多个不同质量或密度的颗粒（如细胞、细胞器、大分子复合物或分子等）沉降到试管的底部的速度是不一样的，质量越大或密度越高沉降的速度就越快。
离心过程简单地说就是给悬浮在溶液中的颗粒施加一个外力，使之沉降速度大大加快（不同质量或密度的颗粒的沉降速度同样程度地加快，但相互之间的速度还是不同的）。这种离心力的大小取决于转子的转速，即每分钟旋转的次数（rmp）和试管离转子中心的距离。
去除细胞碎片，用差异离心即可。选择合适的离心力和离心时间就可将固体型的细胞碎片和细胞器沉降到离心管的底部形成沉淀；绝大多数蛋白质分子或蛋白复合体保留在上清中，这种上清液一般被称为“细胞抽提液”（cell extracts）。细胞抽提液中的目标蛋白可通过以下方法纯化。
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