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试管斜面培养基灭菌用什么塞子

时间:2022-02-14 百科知识 版权反馈
【摘要】:橡胶塞四周应紧贴管壁和瓶壁,不能有皱折,以防止空气微生物沿塞皱折侵入。消毒则是指破坏或消灭病原微生物,只能杀死微生物的营养细胞,而不能杀死全部芽孢。这样,高压蒸汽灭菌时微生物体受热、湿及压力的作用而被杀死。培养基、药物、实验器机械、玻璃器皿和衣物等均可用此法灭菌。在主体内加入清水至刻度,使水位一定要超过电热管,连续使用时,必须在每次灭菌前补足水量,以免干、热使电热管烧坏或发生事故。
实验内容_环境工程微生物实

三、实验内容

(一)玻璃器皿的洗涤和包装

1.洗涤

玻璃器皿在使用前必须洗涤干净。培养皿、试管锥形瓶等可用洗衣粉加去污粉洗刷并用自来水冲净。移液管先用洗液浸泡,再用水冲洗干净。洗刷干净的玻璃器皿自然晾干或放入烘箱中烘干、备用。

2.包装

(1)培养皿由一底一盖组成一套,用牛皮纸将10套培养皿包好。

(2)移液管的吸端用细铁丝将少许棉花塞入构成1~1.5cm长的棉塞,吸时既能通气,又不致使棉花滑入管内。将塞好棉花的移液管的尖端放在4~5cm宽的长纸条的一端,移液管与纸条约成30°夹角,折叠包装纸包住移液管的尖端,用左手将移液管压紧,在桌面上向前搓转,纸条螺旋式地包在移液管外面,余下纸头折叠打结。按实验需要,可单支包装或多支包装,待灭菌。

3.用带砂芯的橡胶塞将试管口和锥形瓶瓶口部塞住

橡胶塞要选择适宜,不宜过松或过紧,用手提橡胶塞,以管、瓶不掉下为准。橡胶塞四周应紧贴管壁和瓶壁,不能有皱折,以防止空气微生物沿塞皱折侵入。胶塞插入2/3,其余留在管口(或瓶口)外,便于拔塞。

试管、锥形瓶塞好橡胶塞后,用牛皮纸包扎并用线绳捆扎好,放在铁丝篓内待灭菌。

(二)培养基的制备

1.配制溶液

取一定容量的烧杯盛入定量无菌水,按培养基配方逐一称取各种成分,称量时一般用1:1 000粗天平即可。依次加入水中溶解,难溶的物质,例如蛋白质、肉膏等,可加热促进溶解,待全部溶解后,加水补足加热蒸发的水量。

配备固体培养基,加热融化琼脂时要不断搅拌,避免琼脂糊底烧焦,且注意控制火力使不至溢出。

2.调节pH值

用精密pH试纸测培养基的pH值,按pH值的要求用10%NaOH或10%HCl调整至所需的pH值。调时需注意逐步滴加,勿使过酸或过碱而破坏培养基中某些组分。

3.过滤

用纱布或滤纸或棉花过滤均可。如果培养基杂质很少或实验要求不高,可不过滤。

4.分装(图7-1)

将培养基分装于试管或锥形瓶中(注意防止培养基玷污管口或瓶口,避免浸湿橡胶塞引起杂菌污染),装入试管的培养基量视试管的大小及需要而定,一般制斜面培养基时,每支试管装的量为试管高度的1/5左右为宜;三角瓶以不超过其容积的一半为宜;半固体培养基以试管高度的1/3左右为宜。

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图7-1 培养基的分装

5.加橡胶塞

试管和三角瓶口需用橡胶堵塞,主要目的是过滤除菌,避免污染。

6.灭菌

在装培养基的三角瓶或试管的橡胶塞外面包一层牛皮纸即可灭菌。应用铅笔注明培养基名称、配制日期等。

如制斜面培养基时,灭菌后趁热将试管斜放(图7-2),注意勿使培养基沾染橡胶塞,使试管内的培养基斜面长度在试管长度的1/3~1/2之间,待培养基凝固后即成斜面。

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图7-2 置放成斜面的试管

如制平板培养基(图7-3)时,灭菌后待培养基温度降至45~50℃时以无菌操作将培养基倒入无菌培养皿内,每皿15~20ml,平放冷凝即成平板培养基,简称平板。具体操作过程如下:右手拿装有培养基的锥形瓶,左手拿培养皿,以中指、无名指和小指托住皿底,拇指和食指夹住皿盖,靠近火焰,将皿盖掀开,倒入培养基后盖上盖子平放在无菌的实验台上,等凝固待用。

若制半固体深层培养基,灭菌后垂直放置,冷凝即成。

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图7-3 平板培养基的制备

7.无菌检查

灭菌后的培养基,尤其是存放一段时间后才用的培养基,在应用之前应置37℃温箱内1~2天,确定无菌后才可使用。

(三)本实验用的制备

1.培养基配方

牛肉膏0.1g,蛋白胨1g,NaCl0.5g,琼脂0.5~2g,蒸馏水100ml,pH=7.6。

灭菌:1.05kg/cm220分钟。

2.操作

(1)取200ml的烧杯一个,装100ml蒸馏水。

(2)在药物天平上依次称取配方中各成分,放入水中溶解,待琼脂完全融化后停止加热补足蒸发损失的水量。用10%NaOH调整pH值至7.6,本实验省略过滤。将培养基分装5支试管中,其余全部倒入200ml的锥形瓶中,分别塞上橡胶塞,包扎好待灭菌。

(四)无菌稀释水的制备

(1)取一个250ml的锥形瓶装90(99)ml蒸馏水,放30颗玻璃珠于锥形瓶内,塞橡胶塞、包扎,待灭菌。

(2)另取5支18×180ml的试管,分别装9ml蒸馏水,塞橡胶塞、包扎,待灭菌。

(五)灭菌

灭菌指杀死或消灭所有微生物体。消毒则是指破坏或消灭病原微生物,只能杀死微生物的营养细胞,而不能杀死全部芽孢。

灭菌与消毒的方法很多,可概分为物理的和化学的两类。实验室常用的方法介绍如下。

1.高压蒸汽灭菌

高压蒸汽灭菌是一种湿热灭菌法。在湿热情况下,菌体吸收水分,使蛋白质易于凝固;同时,湿热的穿透力强,而且当蒸汽与被灭菌物体接触冷凝成水时,又可放出热量,使温度迅速升高,从而增加灭菌效力;另一方面,随着压力增高,达到饱和蒸汽时所具有的温度也高(表7-1)。这样,高压蒸汽灭菌时微生物体受热、湿及压力的作用而被杀死。

表7-1 高压蒸汽灭菌时压力与温度的关系

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注:1kg/cm2=98 066.5Pa;11b/in2=6 894.76Pa

由于高压蒸汽灭菌具有灭菌效果好、适用面广的特点,因此,是实验室最常用的消毒灭菌方法。培养基、药物、实验器机械、玻璃器皿和衣物等均可用此法灭菌。表7-2所示为各种物品消毒参考表。

表7-2 各种物品消毒灭菌参考表

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高压蒸汽灭菌器具有多种不同结构和规格,有自动控制的,也有人工控制的,但其基本工作原理都是利用饱和蒸汽灭菌,如图7-4所示。

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图7-4 高压蒸汽灭菌器

灭菌步骤如下:

(1)堆放。将待灭菌的物品予以妥善包扎,各包之间留有间隙顺序地堆放在灭菌桶的筛板上。这样可有利于蒸汽的穿透,提高灭菌效果。

(2)加水。在主体内加入清水至刻度,使水位一定要超过电热管,连续使用时,必须在每次灭菌前补足水量,以免干、热使电热管烧坏或发生事故。

(3)密封。将堆好的物品的灭菌桶放在主体内,然后把盖上的放气软管插入灭菌桶内侧的圆槽内。对正盖与主体的螺栓槽,顺序地将相对方位的翼形螺母均匀旋紧,使盖与主体密合。

(4)加热。将灭菌器接上与要求电压一致的电源,按动电源开关至“开”,指示灯亮,表示电热管已通电加热。在加热开始时,应将放气阀的摘子推至垂直“放气”方位,使空气随着加热由桶内逸去。待有较急的蒸汽喷出时,即将该摘子扳回水平“关闭”方位。此时压力表加热针会随着加热逐渐上升,指示出灭菌器内的压力。

(5)灭菌。当压力到达所需的范围时,开始计算灭菌所需时间,并使之维持恒压。当应用0.14MPa,124~126℃灭菌时,则安全阀能使之维持恒压。若采用低于上述温度时,则应在蒸汽压力到达所需范围时,适当调节电源开关“开”、“关”的加热时间使之维持恒压。或接上一只调压变压器10~15分钟,使物品上残留的水蒸气得到蒸发,随后将电源开关拔至“关”,停止加热。

(6)冷却。在液体灭菌时,当灭菌时间终了后,切勿立即将灭菌锅内的蒸汽予以排出。否则,由于液体的温度未能迅速下降,而压力蒸汽突然释放,会使液体激烈沸腾,造成溢出或容器爆裂等危险事故。所以在灭菌终了时,必须先将电源开“开”按至“关”,停止加热,待其冷却,直至压力表指针回复至零位,再待数分钟后,打开放气阀。排出余汽后,才能将盖开启。

(7)揭开锅盖,取出器物,将锅内剩余水放掉。

(8)待培养基冷却后置于37℃恒温箱内培养24小时,若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。

2.间歇灭菌

间歇灭菌也是一种湿热灭菌法。此法将待灭菌物经3次灭菌,每次灭菌条件为100℃、30分钟,每次灭菌后取出灭菌物一般置28~30℃温箱中培养24小时。这样,前次灭菌未杀死的芽孢经培养萌发为营养体而被再次灭菌时杀死。此法对某些不耐高温的物品和培养基的灭菌特别适用。所用器械为阿诺氏(Arnold)流动蒸汽灭菌器或普通蒸笼,不需加压。

3.煮沸消毒

水的沸点是100℃,在此温度下将待灭菌物品煮沸5分钟,可杀死一切细菌的繁殖体。虽然许多芽孢经煮沸数小时也不一定死亡,但由于形成芽孢的病原菌不多,故此法适用于灭菌要求不高的培养基与物品。如果在水中加入1%~2%碳酸氢钠,可将溶液的沸点提高到105℃,这样既可促进芽孢的杀灭,又可防止金属器皿生锈。

4.干热灭菌

最简单的干热灭菌是火烧法,可用于接种环、接种针、试管口等的灭菌以及废弃物的焚化。微生物实验室中常用的干热灭菌是指干热空气灭菌,它适宜于玻璃器皿、金属用具等的灭菌,但不能用于培养基等含水分物品。

干热灭菌使用的器械为恒温干燥箱(烤箱),操作步骤如下:

(1)将包扎好的待灭菌物置入箱内,注意不要放得太挤,以利空气流通。

(2)关门,接通电源,拨动开关,旋动恒温调节器至指定温度。通常用160~170℃,超过180℃后易使包扎用纸炭化。

(3)温度上升至指定温度后维持2小时。

(4)灭菌完毕后中断电源,待温度降至70℃以下时,方可开箱取物。

5.过滤除菌

过滤除菌适用于不能用热力灭菌的培养基或其他溶液,如抗菌素、血清、疫苗等。常用的滤器有蔡氏滤器和玻璃滤器。玻璃滤器的滤板由玻璃粉热压而成,具有微孔。过滤除菌常用的玻璃滤器型号为G5和G6。蔡氏滤器使用混合纤维素酯微孔滤膜,孔径有0.2μm和0.45μm等不同规格。一般认为0.2μm孔径滤膜可阻留去除大部分细菌;如果灭菌要求不高,0.45μm的滤膜也可将细菌计数减少至零个/ml或≤10个/ml。

滤膜法过滤除菌时操作步骤如下:

(1)对于少量待灭菌的液体,可用图7-5中的(a)装置(提前灭菌后)直接进行灭菌;对于待灭菌液体量大时,采用图7-5中的(b)装置进行灭菌,首先将滤器、接液瓶和垫圈分别用纸包好,滤膜可放在平皿内用纸包好。在使用前先经121℃高压蒸汽灭菌30分钟。

(2)以无菌操作把滤器装置依照图7-5中的装好。

(3)用灭菌无齿镊子将滤膜安放于隔板上,滤膜粗糙面向上。

(4)将待除菌液体注入滤器内,开动真空泵即可除菌。

(5)滤液经培养证明无菌生长可保存备用。

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图7-5 过滤除菌装置示意图

(a)带注射器的过滤装置;(b)带抽滤的过滤装置

6.紫外线灭菌

紫外线灭菌用紫外线灯管进行。波长在220~300nm的紫外线被称为紫外线的“杀生命区”,其中以260nm的紫外线杀菌力最强。该紫外线作用于细胞DNA,使DNA链上相邻的嘧啶碱形成嘧啶二聚体(主要是胞腺嘧啶二聚体),从而抑制DNA复制。另外,空气在紫外线照射下可产生臭氧,臭氧也有一定的杀菌作用。紫外线透过物质的能力很差,所以只适用于空气及物体表面的灭菌。它与被照物的距离以不超过1.2m为宜。照射时间应视紫外灯管的功率大小、被照空间及面积大小,根据灭菌效果测定结果而定。紫外线对人体有伤害作用,不要在开灯时工作。

7.化学灭菌与消毒

表7-3列出了实验室常用的化学灭菌药剂及使用方法。

表7-3 常用的化学消毒灭菌药剂

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续表7-3

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*加热熏蒸:按熏蒸空间计算,量取甲醛溶液,盛在小铁筒内,用铁架支好。将室内各种物品准备妥当后,点燃置于铁架下的酒精灯,关闭房门,任甲醛溶液煮沸挥发。酒精灯最好能在甲醛蒸完后自行熄灭。**氧化熏蒸:按甲醛液用量一半称取高锰酸钾于一瓷碗或玻璃容器内,再量取所需的甲醛溶液,室内准备妥当后,把甲醛倒在盛有高锰酸钾的器皿内,立即关门。几分钟后,甲醛溶液即沸腾而挥发。高锰酸钾是一种强氧化剂,当它与一部分甲醛液作用时,由氧化作用产生的热即可使其余的甲醛液挥发为气体。甲醛液熏蒸应在使用前至少24小时进行,熏蒸气密闭维持12小时以上,再行处理使用。熏蒸完后量取与甲醛液等量的氨水,迅速放入室内,可减弱甲醛液熏蒸对人眼、鼻的强烈刺激作用。

思考题

1.培养基是根据什么原理配制成的?肉膏蛋白胨琼脂培养基中的不同成分各起什么作用?

2.培养基的种类有哪些?各自特点及用途有哪些?

3.培养基中应具备哪些条件?

4.试述制备培养基的方法和步骤。

5.消毒灭菌可采用哪些方法?各适用于何种情况?

6.为什么湿热灭菌比干热灭菌优越?

7.高压蒸汽灭菌时应注意什么问题?为什么?

8.灭菌与消毒的区别是什么?

9.为什么微生物操作技术中特别强调无菌环境?

10.做过本次实验后,你认为在制备培养基时要注意些什么问题?

11.灭菌在微生物学实验操作中有何重要意义?

12.试述高压蒸汽灭菌的操作方法和原理。

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