黄嘌呤氧化酶－细胞色素法（法）

13．2．1　黄嘌呤氧化酶－细胞色素c法（McCord法）

13．2．1．1　原理

在有氧条件下，黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤生成尿酸，同时产生，将氧化型细胞色素c还原为还原型细胞色素c，后者在550nm有最大吸收。存在SOD时，被催化而歧化，细胞色素c还原反应速率则降低。根据细胞色素c在加入SOD前后被还原的速率变化以测定SOD活性。

在细胞色素c还原法中，产生体系为黄嘌呤－黄嘌呤氧化酶，其检测体系为可被还原的氧化型细胞色素c。

两种反应的速率之比取决于pH、黄嘌呤浓度与O₂的分压。pH与O₂的分压愈高，则的产量愈增加，而增高的黄嘌呤浓度却使产量下降。

13．2．1．2　酶活性单位定义

在pH为7．8、25℃的实验条件下，3mL反应液中，每1min抑制氧化型细胞色素c还原率达50%的酶量定为一个活性单位或McCord单位（u），测定波长为550nm，并规定每1min的吸光度变化值（ΔA_550nm）保持在0．025min。

式中，ΔA₅₅₀为氧化型细胞色素c还原的每1min 550nm吸光度变化值；V_总为测定反应液总体积，为3mL（V_定义：3mL）；V_样为测定反应所用样品体积，为0．3mL。

13．2．1．3　测定方法

pH为7．8，0．3mmol/L磷酸钾缓冲液（含0．6mmol/L EDTA）0．5mL，6×10^－5mol/L氧化型细胞色素c 0．5mL，0．3mmol/L黄嘌呤液0．5mL，双蒸水1．3mL，在25℃预保温10min，最后加入9．0×10^－5u/mg的黄嘌呤氧化酶0．2mL，并立即计时，速率变化在2min内有效，控制黄嘌呤氧化酶浓度，使ΔA_550nm为0．025/min，测定SOD活性时，加入0．3mL SOD待测液，双蒸水减至1．0mL，根据抑制程度，计算出SOD活性（见表13－2）。

表13－2　黄嘌呤氧化酶－细胞色素c法加样表

13．2．1．4　方法特点

该法为最早建立的活性测定法，被认为是一种经典可靠的方法，可应用于生物样品中Cu，Zn－SOD的活性测定。虽然产量很低，但很稳定，符合酶活性测定的要求。常存在氧化型细胞色素c和黄嘌呤氧化酶不纯的问题。

生物样品中易有干扰杂质，灵敏度较低。灵敏度可采取以下措施得到提高：①用乙酰化细胞色素c代替细胞色素c，可将灵敏度提高一倍，而且使测定结果不受样品中细胞色素c氧化酶的影响；②将pH为7．8，0．05mmol/L磷酸钾缓冲液换成pH为10．2的碳酸盐缓冲液，并将黄嘌呤浓度从0．05mmol/L增至0．10mmol/L，灵敏度可提高10倍；③预先将黄嘌呤－黄嘌呤氧化酶溶液在25℃下保温10min，使产量达到稳定程度，即产生率与其自动歧化率达到平衡，灵敏度增加可高达10倍；④另外有报道，利用FP9平行分析仪可进行半自动分析，快速、简便，可以同时测定多个样品。