课堂笔记
一、免疫学检测原理★★
免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验手段，以及分子生物学技术在免疫学研究中的应用。
免疫学技术的应用极为广泛，疾病的诊断、疗效评价及理论研究等。
（一）抗原抗体反应的特点
1．抗原抗体反应的特异性 在抗原抗体反应中，可用已知抗体检测未知抗原，也可用已知抗原检测未知抗体，并可根据需要选择定性或定量的测定方法。
（1）第一抗体（简称一抗）：用已知抗原免疫人或动物后，机体会产生特异性抗体存在于血清中。
（2）抗抗体：又称第二抗体（简称二抗）。由于Ig有同种型抗原特异性，将人Ig免疫动物，或将动物Ig免疫异种动物制备出的抗体。
（3）抗血清：用上述方法制备的血清。
2．抗原抗体反应的可见性 抗原和抗体结合是否呈现可见的反应现象，与两者的分子比例密切相关。还可借助标记物或无关载体来指示抗原抗体反应，帮助结果的判定。
抗原-抗体反应受多种因素影响。①电解质：抗原抗体反应通常应用0．85%的氯化钠作为稀释液，以供给适应浓度的电解质。②温度：一般抗原-抗体反应常在37℃水浴或孵育箱中进行。③酸碱度：抗原抗体反应适应的酸碱度为pH 6～8。
（二）抗原抗体反应的基本检测方法
1．凝集反应 细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集团块，这一类反应称为凝集反应。该类反应可检测到1μg／ml水平的抗体。
（1）直接凝集：将细菌或红细胞与相应抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。
玻片凝集试验：用于定性检测抗原，如ABO血型鉴定、细菌鉴定。
试管凝集试验：在试管中系列稀释待检血清，加入已知颗粒性抗原，用于定量检测抗体，如诊断伤寒病的肥达试验。
（2）间接凝集：可分为间接凝集和间接凝集抑制试验。
2．沉淀反应 血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物，这一类反应称为沉淀反应。该类反应可检测到20μg／ml～2mg／ml水平的抗体或抗原。
（1）单向免疫扩散：是将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制琼脂板，在适当位置打孔后将抗原加入孔中扩散。抗原在扩散过程中与凝胶中的抗体相遇，形成以抗原孔为中心的沉淀环，环的直径与抗原含量成正相关。该法可用于测定血清IgG、IgM、IgA和补体C3等的含量（图9-1）。
（2）双向免疫扩散：本法可用于抗原或抗体的定性、定量检测及组分分析（图9-2）。
（3）免疫电泳：是先将待侧血清标本作琼脂凝胶电泳，血清中各蛋白组分被分成不同的区带，然后与电泳方向平行挖一小槽，加入相应的抗血清，把分成区带的蛋白抗原成分作双向免疫扩散，在各区带相应的位置形成沉淀弧。该法常用于血清蛋白种类分析，以观察Ig的异常增多或缺失。可分析待测标本中所含抗原成分的性质和含量。该法常用于血清蛋白种类分析，以观察Ig的异常增多或缺失。如多发性骨髓瘤及性联低丙种球蛋白血症的诊断。
图9-1 单向琼脂糖扩散实验
图9-2 双琼脂扩散沉淀线基本图形
（4）免疫比浊：在一定量的抗体中分别加入递增量的抗原，经一定时间后形成免疫复合物。用浊度计测量反应液体的浊度，复合物形成越多，浊度越高，绘制标准曲线并根据反应液体的浊度推算样品中的抗原含量。该法快速简便，可取代单向免疫扩散测定的Ig含量。
3．补体参加的反应 利用抗体与红细胞上的抗原结合，激活反应体系中的补体，导致红细胞的溶解，用溶血现象帮助判定结果。补体结合试验曾用于检测多种细菌、病毒的抗原或抗体，因操作烦琐已逐渐被其他方法取代。
4．借助标记物的抗原抗体反应 用荧光素、放射性核素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原抗体反应。标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变抗体（或抗原）的免疫学特性，同时标记物的性质依然存在，因而极大地提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。
（1）免疫荧光法：用荧光素（常用的有异硫氰酸荧光素，FITC）与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本的抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。免疫荧光法可用于检查细菌、病毒、螺旋体等的抗原或相应抗体，辅助传染病的诊断。还用于鉴定免疫细胞的CD分子，检测自身免疫病的抗核抗体等。
直接荧光法：将荧光素直接标记抗体作标本染色。优点：特异性强。缺点：每检测一种抗原必须制备相应的荧光抗体。
间接荧光法：用一抗与标本中的抗原结合，再用荧光素标记的二抗染色。优点：敏感性比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检测。缺点：非特异性荧光亦会增加。
（2）酶免疫测定（EIA）：是用酶［常用的有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）］标记的抗体进行的抗原抗体反应。EIA将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后显色来判定结果。常用的方法有酶联免疫吸附试验和酶免疫组化法，前者测定可溶性抗原或抗体，后者测定组织中或细胞表面的抗原。
酶联免疫吸附试验（ELISA）的基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将固相上的抗原抗体复合物与液相中的游离成分分开。ELISA的操作方法很多，以下简介几种基本方法。
①双抗体夹心法：用于检查特异抗原。将已知抗体包被在酶联检测板上，加入待检标本，标本中若含有相应抗原即与固相上的抗体结合，洗涤去除未结合成分，加入该抗原特异的酶标记抗体，洗去未结合的酶标记抗体，加底物后显色。一般而言，包被抗体和酶标记的抗体是识别同一抗原上的不同抗原决定基的两种抗体。
②间接法：用于检查特异抗体。用已知抗原包被固相，加入待检血清标本，再加酶标记的二抗，加底物观察显色反应。
③BAS-ELISA：在生物素-亲和素系统（BAS）中利用生物素-亲和素-酶的连接关系追踪生物素标记抗体所识别的抗原，进一步提高了检测的灵敏度。生物素也可结合核苷酸，因此BAS除用于抗原抗体检测外，还用于DNA和RNA的测定。
④酶联免疫斑点试验（ELISPOT）：其基本原理是用已知细胞因子的抗体包被固相载体，加入待检的效应细胞，温育一定时间后洗去细胞，如待检效应细胞产生相应细胞因子，则与已包被的抗体结合，再加入酶标记抗该细胞因子抗体，加底物显色。该法用于效应细胞分泌的单一细胞因子的测定，避免了生物活性测定法中多种细胞因子相同生物活性的干扰。
⑤免疫组化技术：用标记物标记的抗体与组织或细胞的抗原反应，结合形态学检查，对抗原作定性、定量、定位检测的技术。现广泛应用的有酶免疫组化（辣根过氧化物酶标记）、免疫金组化（胶体金颗粒标记）、免疫电镜技术（铁蛋白、胶体金、过氧化物酶标记）等。
（3）放射免疫测定法（RIA）：是用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测的技术。检测的敏感度达pg／ml水平。常用于标记的放射性核素有125I和131I。常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物质的测定。
（4）化学发光免疫分析：将发光物质（如吖啶酯、鲁米诺等）标记抗原或抗体进行反应，以反映待检样品中抗体或抗原的含量。该法灵敏度高于放射免疫测定法，常用于血清超微量活性物质的测定，如甲状腺素等激素。
（5）免疫印迹法：将凝胶电泳与固相免疫测定结合，先把电泳分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶免疫、放射免疫等技术测定。该法能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量。常用于检测多种病毒如HIV的抗体或抗原。
（三）免疫细胞的检测
检测各群体淋巴细胞的数量与功能是观察机体免疫状态的重要手段。
病人主要的检测标本为外周血，但仅代表再循环的淋巴细胞。
实验动物还可取胸腺、脾、淋巴结等作为标本进行检查。
1．淋巴细胞的分离与类型鉴定
图9-3 淋巴细胞的分离——密度梯度离心法
制备外周血单个核细胞（PBMC）（图9-3）。
（1）花结试验：E花结试验可用于检测T细胞数目。EA花结试验可用于检测B细胞数目。
（2）免疫荧光法：常采用间接免疫荧光法。
（3）流式细胞术：借助流式细胞仪（FCM）。
2．T细胞功能测定
（1）T细胞增殖试验：原理为人T细胞表面有PHA或ConA受体，T细胞在体外受PHA或ConA的刺激后能转化为体积较大、代谢旺盛且能进行分裂的淋巴细胞，以此测定T细胞的功能。定量检测细胞增殖的方法主要有以下两种。
①3 H-TdR掺入法：方法灵敏可靠，应用广泛，但需特殊仪器，且易有放射性污染。
②MTT法：反映细胞增殖水平的高低。此法也用于某些细胞因子活性的测定（细胞因子依赖的细胞株增殖法）。MTT法敏感性虽不及3 H-TdR掺入法，但操作简便，无放射性污染。
（2）细胞毒试验：CTL、NK细胞对靶细胞有直接杀伤作用，可根据待检效应细胞的性质，选用相应的靶细胞，如肿瘤细胞、移植供体细胞等。该试验用于肿瘤免疫、移植排斥反应、病毒感染等方面的研究。包括：51 Cr释放法、乳酸脱氢酶释放法、凋亡细胞检查法。
（3）细胞因子检测：细胞因子的检测有助于了解其在免疫调节中的作用，鉴定分离的淋巴细胞，监测某些疾病状态的细胞免疫功能。例如，根据培养的CD4＋细胞分泌的细胞因子确定细胞亚群，产生IL-12、IFN-γ者为Th1，产生IL-4、IL-10者为Th2。细胞因子的检测方法可分ELISA、生物活性测定法、合酶链反应（PCR）三种。
（4）皮肤试验：正常机体建立了对某种抗原的细胞免疫后，用相同抗原作皮肤试验时即出现以局部红肿为特征的迟发型超敏反应。
细胞免疫正常者出现阳性反应，而细胞免疫低下者则呈阴性反应。
皮肤试验方法简便，可辅助诊断某些病原微生物感染（如结核杆菌、麻风杆菌）、免疫缺陷病等以及疫苗接种后的免疫效果（如卡介苗）。
皮肤试验常用的生物性抗原常从病原体中提取，如结核菌素、麻风菌素、念珠菌素、腮腺炎病毒等。
3．B细胞功能测定 B细胞介导体液免疫，检查B细胞的数量与功能是确定体液免疫正常与否的重要手段之一，可辅助原发性体液免疫缺陷的诊断。
（1）B细胞增殖试验。
（2）抗体形成细胞测定：常用溶血空斑试验，即测定对绵羊红细胞（SRBC）上的抗原产生的抗体形成细胞的数目。其基本原理是抗体形成细胞分泌的Ig与SRBC上的抗原结合，在补体参与下，出现溶血反应。方法是将吸附有已知抗原的SRBC、待检的B细胞、补体及适量琼脂糖液混合，倾注于平皿，温育1～3h后，肉眼可见有分散的溶血空斑出现，每一空斑中央含一个抗体形成细胞，空斑的数量即为抗体形成细胞数。此外，也可用ELISPOT法检查特异抗体形成细胞。
4．吞噬细胞功能测定
（1）趋化功能测定：①琼脂糖凝胶法；②过氧化物酶测定法。
（2）吞噬功能测定
①硝基蓝四氮唑试验：在抗凝全血或白细胞悬液中加入硝基蓝四氮唑（nitroblue tetrazolium，NBT）溶液，能使被吞噬入细胞内的NBT还原成不溶解的暗蓝色甲臜，沉积于细胞质中，称NBT阳性细胞。光镜下计数NBT阳性细胞，其百分率可反映中性粒细胞的杀伤功能。
②荧光标记物试验：将荧光素标记的生物颗粒（如大肠埃希菌、白色念珠菌等）与白细胞悬液混合，温育一定时间后加入台盼蓝并洗涤，以去除未被吞噬的荧光颗粒，离心收集细胞，重悬后用荧光分光光度计定量分析。
二、免疫学在药学中的应用★
生物制药产品主要包括基因工程药物、抗体工程药物、血液制品、生物疫苗和生物诊断试剂等，用于疾病的诊断、预防和治疗。
（一）免疫诊断
1．感染性疾病
2．免疫缺陷病
3．自身免疫病
4．超敏反应性疾病
5．肿瘤
6．优生优育
7．免疫学监测
（二）免疫预防
1．人工主动免疫 人工主动免疫是用疫苗接种机体，使之产生特异性免疫，从而预防感染的措施。
疫苗：用于人工主动免疫的生物制品，包括细菌性制剂、病毒性制剂以及类毒素等。
（1）灭活疫苗：选用免疫原性强的病原体，经人工大量培养后，用理化方法灭活制成。
机制：诱导特异性抗体产生，常需要多次接种。如伤寒、百日咳、霍乱、流感、狂犬病、乙型脑炎疫苗等。
（2）减毒活疫苗：是用减毒或无毒力的活病原微生物制成。
缺点：是疫苗体内回复突变的可能性，尽管十分罕见，但仍需警惕。免疫缺陷者和孕妇一般不宜接种活疫苗。如卡介苗、麻疹活疫苗、脊髓灰质炎活疫苗等。
（3）类毒素：是用细菌的外毒素经0．3%～0．4%甲醛处理制成。常用的制剂有破伤风类毒素、白喉类毒素。
2．人工被动免疫 人工被动免疫是给人体注射含特异性抗体的免疫血清制剂，以治疗或紧急预防感染的措施。
（1）抗毒素：是用细菌外毒素或类毒素免疫动物制备的免疫血清，具有中和外毒素毒性的作用。常用的有破伤风抗毒素、白喉抗毒素等。
（2）人免疫球蛋白制剂：是从大量混合血浆或胎盘血中分离制成的免疫球蛋白浓缩剂，如乙型肝炎免疫球蛋白。
3．新型疫苗
（1）亚单位疫苗：是去除病原体中与激发保护性免疫无关的甚至有害的成分，保留有效免疫原成分制作的疫苗。例如，从乙型肝炎病毒表面抗原阳性者血浆中提取表面抗原制成的乙型肝炎疫苗。
（2）结合疫苗：近年来发展的结合疫苗是将细菌荚膜多糖的水解物与白喉类毒素通过化学连接，为细菌荚膜多糖提供蛋白质载体，使其成为T细胞依赖性抗原。结合疫苗能被T、 B细胞联合识别，B细胞产生IgG类抗体，获得了良好的免疫效果。目前已获准使用的结合疫苗有脑膜炎球菌疫苗和肺炎链球菌疫苗等。
（3）合成肽疫苗：目前研究较多的是抗病毒和抗肿瘤多肽疫苗，如艾滋病病毒、肝炎病毒等。
（4）重组抗原疫苗：是利用DNA重组技术制备的只含保护性抗原的纯化疫苗。此类疫苗不含活的病原体和病毒核酸，安全有效，成本低廉。目前获准使用的有乙型肝炎疫苗、口蹄疫疫苗和莱姆病疫苗等。
（5）重组载体疫苗：目前使用最广的载体是痘状病毒，用其表达的外源基因很多，已用于乙型肝炎、麻疹、单纯疱疹等疫苗的研制。
（6）DNA疫苗：又称核酸疫苗，疫苗的发展方向之一。
（7）转基因植物疫苗：常用的植物有蕃茄、马铃薯、香蕉等。这类疫苗尚在初期研制阶段，它具有可口服、易被儿童接受、价廉等优点。
4．计划免疫 计划免疫是根据某些特定传染病的疫情监测和人群免疫状况分析，按照规定的免疫程序有计划地进行人群预防接种，提高人群免疫水平，达到控制以至最终消灭相应传染病的目的而采取的重要措施。
（三）免疫治疗
免疫治疗是指利用免疫学原理，针对疾病的发生机制，人为地调整机体的免疫功能，以达到治疗目的所采取的措施。
1．分子疫苗 合成肽疫苗、重组载体疫苗和DNA疫苗可作为肿瘤和感染性疾病的治疗性疫苗。
2．细胞疫苗 包括肿瘤细胞疫苗、基因修饰的疫苗、树突状细胞疫苗。
3．抗体 主要是抗感染的免疫血清。
4．细胞因子 重组细胞因子已用于肿瘤、感染、造血障碍等疾病的治疗。
5．过继免疫治疗 取自体淋巴细胞经体外激活、增殖后回输患者，直接杀伤肿瘤或激发机体抗肿瘤免疫效应，此为过继免疫治疗。这些细胞能直接杀伤肿瘤细胞，与IL-2联合治疗晚期肿瘤，有一定疗效。
6．造血干细胞移植 取患者自身骨髓、异体骨髓或脐血，分离造血干细胞，转输给患者。其中多能干细胞可在体内定居、增殖、分化，使患者恢复造血功能和增强其免疫力。该疗法可用于治疗免疫缺陷病、再生障碍性贫血以及白血病等。
7．生物应答调节剂（BRM） 指具有促进或调节免疫功能的制剂，通常对免疫功能正常者无影响，而对免疫功能异常，特别是免疫功能低下者有促进或调节作用。
制剂包括：细胞因子、微生物制剂、其他生物制剂、真菌及植物多糖、合成性分子等。
8．免疫抑制剂 免疫抑制剂能抑制机体的免疫功能，常用于防止移植排斥反应的发生和自身免疫病的治疗。随着器官移植的发展，免疫抑制剂的应用日益增多。
制剂包括：糖皮质激素、环磷酰胺、硫唑嘌呤、麦考酚酸酯（mycophenolate，MMF）、环孢素A（cyclosporin A，CsA）、FK- 506（商品名他克莫司，属大环内酯抗生素，为真菌产物）、雷帕霉素。
重点难点提示
1．掌握抗原抗体反应的特点，抗原抗体检测的基本检测方法。
2．熟悉免疫细胞的检测。
3．熟悉免疫预防。
4．了解免疫诊断和免疫治疗。
测试及考研
一、最佳选择题
1．分析两种抗原的相关性（ ）
A．双向免疫扩散 B．免疫电泳
C．单向免疫扩散 D．ELISA
E．免疫比浊
本题考点：抗原的基本检测方法。
2．T细胞增殖试验不选用（ ）
A．SPA B．ConA
C．3 H-TdR D．PHA
E．MTT
本题考点：免疫细胞的检测方法。
3．对灭活疫苗叙述有误的是（ ）
A．用免疫原性强的病原体灭活制成
B．需多次接种
C．注射的局部和全身反应较重
D．保存比活疫苗方便
E．能诱导细胞免疫形成和特异性抗体产生
本题考点：免疫防治灭活疫苗的特点。
二、问答题
1．可用哪些方法定量检测血液标本中的抗原？
2．常用的人工免疫制剂有哪些？
答案：
一、1．A；2．A；3．E
二、1．首先考虑血液标本中的抗原可能有哪些种类，然后根据这些抗原的性质选择定量测抗原的有关方法。血液标本中常检测的抗原主要有机体自身的蛋白质及感染的病原体。自身蛋白质包括激素、免疫球蛋白、补体、细胞因子等；微生物包括细菌、病毒、寄生虫等。定量检测的抗原多为可溶性抗原，完整细菌、寄生虫属颗粒性抗原，本题可不予考虑。而自身蛋白、完整病毒或病原体的结构蛋白等则为可溶性抗原。
免疫球蛋白IgG、IgA、IgM及某些单一补体成分如C3、C4在血清中的含量较高，在制备已知的相应抗体后，选用灵敏度不太高的方法即可。如用免疫比浊法、单向免疫扩散法。
IgG亚类、IgD、IgE的血清含量很低，上述方法的灵敏度达不到要求，不能选用，需采用酶联免疫吸附试验（ELISA）的双抗体夹心法、BAS-ELISA甚至放射免疫测定法，这些方法的灵敏度达ng～pg水平。
血清细胞因子含量很低，定量测定可用细胞因子单克隆抗体包被固相的ELISA双抗体夹心法、BAS-ELISA等方法。
血液激素含量极低，多采用放射免疫测定法或化学发光免疫分析，体内药物含量监测如吗啡、地高辛等也用这些方法。
病毒抗原的血清含量高低不等，需选用较灵敏的方法检测，如ELISA之双抗体夹心法、BAS-ELISA等。某些细菌、寄生虫的结构蛋白或分泌性蛋白为可溶性抗原，也可用上述方法检测。
2．人工免疫制剂包括人工主动免疫和人工被动免疫制剂。
人工主动免疫是用疫苗接种机体，使之产生特异性免疫，从而预防感染的措施。常用的制剂如下。
（1）灭活疫苗（死疫苗）：是将免疫原性强的病原体用理化方法灭活制成。细菌类有霍乱、百日咳、伤寒、钩端螺旋体疫苗等；病毒类有脊髓灰质炎、狂犬病、乙型脑炎、流感疫苗等。
（2）减毒活疫苗：是用减毒或无毒力的活病原微生物制成。细菌类有卡介苗；病毒类有口服脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗等。
（3）类毒素：类毒素是用细菌的外毒素经0．3%～0．4%甲醛处理制成。因其已失去外毒素的毒性，但保留免疫原性，接种后能诱导机体产生抗毒素。如破伤风类毒素、白喉类毒素。
人工被动免疫是给人体注射含特异性抗体的免疫血清制剂，以治疗或紧急预防感染的措施。主要包括抗毒素和人免疫球蛋白制剂。
（1）抗毒素：是用细菌外毒素或类毒素免疫动物制备的免疫血清，具有中和外毒素毒性的作用。主要有破伤风抗毒素、白喉抗毒素等。
（2）人免疫球蛋白制剂：是从大量混合血浆或胎盘血中分离制成的免疫球蛋白浓缩剂。肌内注射剂主要用于甲型肝炎、丙型肝炎、麻疹、脊髓灰质炎等病毒性疾病的预防。静脉注射用免疫球蛋白（IVIG）主要用于原发性和继发性免疫缺陷病的治疗。特异性免疫球蛋白则是由对某种病原微生物具有高效价抗体的血浆制备，用于特定病原微生物感染的预防，如乙型肝炎免疫球蛋白。
（周丽娜）
免责声明：以上内容源自网络，版权归原作者所有，如有侵犯您的原创版权请告知，我们将尽快删除相关内容。
