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如何实现噬菌体蛋白质外壳标记

时间:2022-10-20 百科知识 版权反馈
【摘要】:外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面,而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序推导出来。噬菌体结构蛋白pⅢ和pⅧ均可作为载体来展示外源多肽或蛋白质,在基因操作上,它们基本相同。最后,利用化学合成含一致序列的氨基酸短肽,研究它们的亲和特性并推测可能配体的生物学活性和结合或游离状态的结构特点。
操作步骤_医学分子生物学

噬菌体展示技术以构建的噬菌体为载体,把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质基因区,使外源多肽或蛋白质表达并展示于噬菌体表面,进而通过亲和富集法将表达有特异肽或蛋白质的噬菌体富集。

噬菌体展示技术的建立包括以下3个过程:第一步:外源基因的N端插入。在pⅢ和pⅧ衣壳蛋白的N端插入外源基因,形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面,不影响和干扰噬菌体的生活周期,同时保持的外源基因天然构象,也能被相应的抗体或受体所识别。第二步:筛选。利用固定与固相支持物的靶分子,采用适当的淘洗(panning)方法,洗去非特异结合的噬菌体,筛选出目的噬菌体。第三步:测序及推导。外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面,而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序推导出来。

该技术实现了基因型和表型的转换。噬菌体结构蛋白pⅢ和pⅧ均可作为载体来展示外源多肽或蛋白质,在基因操作上,它们基本相同。在信号肽与成熟蛋白质编码区之间有单一的克隆位点便于插入,插入的外源多肽或蛋白质以融合的形式表达出来并分泌到胞间质内,当宿主蛋白酶切除信号肽后,融合蛋白组装成熟,呈现在病毒粒子的表面,新的N端位置正是外源蛋白或多肽的插入点。与pⅢ基因融合时拷贝数低(不超过5个),这可以减少多价结合,利于选择高亲和力的配体分子,还可容许插入大的片段。与pⅢ基因融合时,拷贝数高(2 700个),当将属于多肽的表位用作免疫原时可产生良好的免疫应答,具有反应优势,故在疫苗开发上具有潜在的应用价值。亲和筛选可用直接法和间接法。直接法是将蛋白质分子偶联到固相支持物上,文库噬菌体与固相支持物温育,洗去未结合的噬菌体,即获得亲和噬菌体;间接法是将生物素标记的蛋白质分子与文库噬菌体温育后铺在结合有链亲和素的平皿上,洗去未结合的噬菌体,保留的就是结合状态的噬菌体,再洗脱结合的噬菌体,用这部分噬菌体感染细菌,扩增噬菌体,开始新一轮的筛选,通过几次这样的亲和纯化反应,就能选择性地富集并特异性扩增结合这种蛋白质或DNA分子的噬菌体。筛选出的噬菌体的结合特性可以进一步验证并从DNA序列推导出来,分析各个克隆间编码短肽的一致序列,以确证筛选的特异性。最后,利用化学合成含一致序列的氨基酸短肽,研究它们的亲和特性并推测可能配体的生物学活性和结合或游离状态的结构特点。

目前,噬菌体展示文库的建立已经比较成熟,可直接从生物试剂公司(如Biolab,Spring等)购买后进行筛选,避免烦琐的建库过程。实验线路如下:文库的扩增→吸附→洗脱→重复以上3个步骤4次→最后一轮洗脱噬菌体对E.coli TG1侵染→侵染菌的10倍梯度稀释和琼脂板涂板→单克隆的分离和培养→克隆菌的辅助噬菌体侵染和ELISA鉴定。流程如图9-6所示。

图9-6 建立噬菌体文库的实验步骤

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